Biotech

PON1

ביוטק 2016: מהי השפעת ריכוז המעכב התחרותי 2HydroxyQuinoline על רמת הפעילות של האנזים PON1 בוריאנט WT?

שמות מבצעי הניסוי: אלה ארליכמן ועומרי קליימן.

תיכון הדרים הוד השרון, י''א2

שמות המנחים: גדי ערמוני וירדנה דוד.

שם המורה: ענת קפלן.

בחסות מכון וייצמן למדע.

רקע מדעי

גז עצבים היא תרכובת אורגנו זרחתית. גז העצבים הוא מעכב תחרותי הנקשר למולקולות האצטילכולין אסטראז והוא מונע את הפסקת פעילותם של תאי המטרה אשר הנוירוטרנסמיטור שלהם הוא האצטילכולין. עקב חשיפה לגז עצבים ישנה את תסמונת האדם הנוזל, הכוללת אי שליטה בסוגרים, הזעה, דמעות... וכמו כן, כיווץ בלתי נשלט של השרירים והרפיית שריר הלב עד למוות ללא טיפול מאיבוד טונוס שרירים, חנק...

כיום קיימת תרופה לגז העצבים ששמה הוא אטרופין. האטרופין נקשר לרצפטורים של הנוירונים וכך מונע כניסה נוספת של אצטילכולין לתאי המטרה הפוסט סינפטיים וכך מונע החמרה של מצב הנחשף לגז. לתרופה זו חיסרון ברור. כיוון שהיא אינה מטפלת בשורש הבעיה אלא מונעת החמרה של הבעיה, ללא טיפול רפואי מיידי החולה ימות ובכל מקרה גם אם יטופל בזמן, יסבול מנזק נוירולוגי.

PON1 הוא אנזים המפרק תרכובות אורגנו זרחתיות כגון גז עצבים. אנזים זה נמצא כרגע בפיתוח והוא נועד להחליף את האטרופין כתרופה לגז העצבים. יתרונותיו הם שהוא מטפל בשורש הבעיה, כלומר, מפרק את גז העצבים ולא רק מונע החמרה של המצב. כמו כן, PON1 הוא אנזים המיוצר באופן טבעי בגוף ולכן אין סכנה שידחה על ידי המערכת החיסונית. בנוסף לכך הוא אנזים ולכן בניגוד לאטרופין הוא יכול לשמש מספר רב של פעמים ולכן צריך כמות קטנה יחסית ממנו לטיפול. לבסוף, הPON1 מיוצר בחיידקים ולכן קל, זול ונוח לייצר אותו בכמויות גדולות.


שאלת המחקר
:
מהי השפעת ריכוז המעכב התחרותי (2HydroxyQuinoline) על רמת הפעילות של הוריאנט WT של PON1?

השערת המחקר: אנו משערים כי ככל שריכוז המעכב התחרותי יעלה כך רמת הפעילות של האנזים PON1 תרד וכתוצאה מכך גם כמות הPNP הנוצרת תהיה קטנה יותר לכל פרק זמן וזאת עד לריכוז מסויים שבו כבר לא יהיה שינוי.

המשתנה הבלתי תלוי ודרך שינויו: המשתנה הבלתי תלוי הוא ריכוז המעכב התחרותי ונשנה אותו דרך יצירת ריכוזים שונים של המעכב התחרותי על ידי מיהולים.

המשתנה התלוי ודרך מדידתו: המשתנה התלוי הוא רמת הפעילות של האנזים ונמדוד אותו דרך מדידת רמת הבליעה של התוצר PNP כתלות בזמן בעזרת הplate reader.

גורמים קבועים: הגורמים הקבועים בניסוי הם: ריכוז הפאראוקסון וריכוז הPON1 בכל הבארות.

בקרה: הבקרה היא בקרה פנימית השוואתית בה נשווה את התוצאות אחת לשנייה.

חזרות: נבצע את הניסוי בשתי חזרות בplate reader (דופליקטים).

הניסוי המקדים

מטרת הניסוי המקדים: הכנת חיידקים המכילים את הגן המקודד לPON1.

רשימת כלים וחומרים: https://docs.google.com/document/d/1Zw6-B3Nge2kqGP8EpSCwUC2qo2cDQ1D656XMxibme9c/edit

משתנים:

משתנה תלוי: כמות מושבות החיידקים שגדלו בכל צלחת.

משתנה בלתי תלוי: 1. האם החיידקים שנזרעו בצלחת הם טרנסגנים או לא.

2. האם מצע הגידול מכיל אגר ואמפיצילין או רק אגר.

תוצאות הניסוי המקדים

Big image
Big image

דיון בתוצאות

לפי התוצאות, ניתן להסיק כי:

ראשית, בבקרה של הניסוי שהיא צלחת חיידקים לא טרנסגנים במצע גידול ללא אמפיצילין גדל מרבד חיידקים גדול שאישר לנו את העובדה כי החיידקים לא מתו במהלך השוק התרמי.

אך התוצאות והמסקנות החשובות באו אלינו משתי צלחות הניסוי האחרות.

הצלחת שהכילה חיידקים לא טרנסגנים על מצע גידול המכיל אמפיצילין לא גדלו ולא יצרו אף מושבה אחת. מכאן ניתן להסיק כי לחיידקים לא הייתה עמידות לאמפיצילין באופן טבעי.

הצלחת שהכילה חיידקים טרנסגנים על מצע גידול בררני יצרו מספר מושבות (38 במספר) ומכאן ניתן להסיק כי החיידקים בחלקם אכן קלטו את הפלסמידים לעמידות לאמפיצילין ולגן המקודד לPON1 ולכן נוצרו מושבות.

הפלסמיד הרקומביננטי בניסוי החקר

הפלסמיד הרקומביננטי בניסוי שלנו: פלסמיד הוא DNA טבעתי. פלסמידים מופיעים לרוב בחיידקים ומקודדים ליצירת חלבונים החיוניים להישרדות התא. הפלסמיד הרקומביננטי מכיל כמה חלקים והם:

Ori: הOri הוא חלק הנמצא על הפלסמיד ומטרתו היא לאפשר את פעולת השכפול של הפלסמיד בתוך תא החיידקים על מנת שיווצרו הרבה פלסמידים המקודדים לPON1 וכך יווצר הרבה PON1 בניסוי שלנו.

עמידות לאמפיצילין: כיוון שאנו נברור בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד ואלו שלא באמצעות המתתם של החיידקים שלא קלטו את הפלסמיד באמצעות אמפיצילין, על הפלסמיד יש עמידות לאמפיצילין על מנת שתתאפשר ברירה זו בין החיידקים.

PON1: על מנת שתא החיידק ייצר לנו את הPON1 הדרוש (ובמקרה שלנו את וריאנט WT) אנו נצרף מקטע המקודד ליצירת אנזים זה ונחברו לפלסמיד וכך נוודא כי לתא החיידק ישנה היכולת לייצר את אנזים זה.

8 היסטידינים: לחלק המקודד לPON1 בפלסמיד אנו נחבר בתחילתו מקטע DNA המקודד לשמונה חומצות אמינו של היסטידין (His). אנו נעשה זאת כיוון שבשלב של ניקוי החלבון באמצעות קולונת הזיקה אנו נרצה שהאנזים שלנו, PON1, יקשר לחרוזי הניקל אשר בקולונה, ומעבר לכך, נרצה שהוא יקשר בצורה הטובה ביותר על מנת שיופרד משאר חלבוני התא. אנו יודעים כי חרוזי הניקל נמשכים בצורה מאד טובה לחומצת האמינו היסטידין ועל כן אנו יודעים כי ככל שנגדיל את כמותן של חומצות אמינו אלו (כפי שעשינו בחיבור שמונה החומצות) אנו נגדיל את סיכוייו של הPON1 להיקשר בצורה הטובה ביותר "ולהדיח" את שאר האנזימים.

אופרון הלקטוז המהונדס: על מנת שנגרום לתא החיידק לייצר את הPON1 שלא נחוץ להישרדותו של החיידק אנו נשתמש באופרון הלקטוז המהונדס שממש יכריח את תא החיידק לייצר את אנזים זה עבורנו, אך בניסוי שלנו נשתמש באנלוג ללקטוז שהוא IPTG במקום בלקטוז וזאת כיוון שיש לו יתרונות על פני הלקטוז. לאופרון זה שני חלקים מרכזיים:

האתר המפעיל (O): אחראי להיקשרות עם הדכאן ומניעה של תעתוק הגנים של האופרון ובמקרה שלנו של הPON1 כאשר זה לא נחוץ לנו (או לתא החיידק באופן טבעי) וזאת על מנת שהתא לא יבזבז אנרגיה לשווא.

האתר המקדם (P): הRNA פולימראז מחל את התעתוק באתר המקדם ותפקידו של אתר זה הוא התחלת פעולת התעתוק של חלבוני האופרון, כלומר, הוא משלים את פעולת האתר המפעיל ומאפשר בפועל תרגום של החלבוניםהרצויים.

ניסוי החקר

מהלך המחקר

לניסוי שלנו יש מספר שלבים ולכולם שיטות ומטרות שונות שאותן נפרט.

1. גידול החיידקים עד אמצע השלב הלוגריתמי

ליצור כמות גדולה של חיידקים המסוגלים להפיק PON1.

מגדלים את החיידקים שנלקחו מהניסוי המקדים במצע גידול נוזלי LB, מוסיפים למצע הגידול אמפיצילין על מנת שמערכת הניסוי לא תזדהם בחיידקים מהסביבה החיצונית. בנוסף לכך נוסיך תמיסת CaCl2 על מנת שהחיידקים יוכלו לסנתז את PON1 המכיל אותם באתר הפעיל. נטלטל את החיידקים על מנת להגדיל את חדירת החמצן כיוון שE.coli הוא חיידק אירובי. על מנת לדעת שהחיידקים הגיעו לאמצע השלב הלוגריתמי נבדוק את רמת הבליעה באורך גל של 600nm, כאשר מגיעים לרמת בליעה של 0.6-0.8 OD אשר תימדד בספקטרופוטומטר ניתן לעצור את גידולם.

מבחנת הבלאנק שלנו תכיל רק את מצע הגידול.

2.הוספת IPTG:

התחלת הביטוי של האנזים PON1 בתאי החיידקים תחת בקרת אופרון הלקטוז.

אופרון הלקטוז הוא אוסף של גנים בתא של חיידקים מסויימים כגון E.coli אשר אחראי לייצור חלבוני פעולה המכניסים לקטוז לתוך תא החיידק בעת צורך (כשזהו הסוכר המשתלם ביותר לפירוק בתוך תא החיידק) ואחראי גם על אי הכנסתו ופירוקו של הלקטוז לתא החיידק כשזהו לא הסוכר המשתלם ביותר לפירוק. אופרון הלקטוז המהונדס אחראי שבעת חשיפה ללקטוז, או במקרה שלנו IPTG שהוא אנלוג ללקטוז לא יווצרו אנזימים שיכניסו לקטוז, אלא תא החיידק יתחיל להפיק את PON1.

אנו נוסיף IPTG למצע הגידול. הIPTG הוא אנלוג של לקטוז והוא נקשר אל הדכאן (רפרסור) של אופרון הלקטוז המהונדס ומנטרל אותו. בעקבות זאת מתחיל תעתוק של הגן הרצוי.

הסיבה שלקחנו IPTG ולא לקטוז היא שלIPTG שני יתרונות: ראשית, הIPTG בניגוד ללקטוז לא יפורק עם הזמן על ידי האנזים בטא-גלקטוזידאז ולכן רמתו תישאר קבועה בתא וקצב ביטוי הגנים יישאר קבוע גם כן. יתרון נוסף הוא שכניסתו של IPTG אל התא איננה תלויה בפעילות הגן lacY המסייע בהעברת לקטוז דרך הממברנה אלא נכנס לתא בדיפוזיה.

3.צנטריפוגה והמשך עם המקטע התחתון:

כך נוכל להמשיך עם החיידקים ולפנות את מצע הגידול וחומרי הפסולת.

לאחר השלב של הוספת הIPTG נרצה להפריד בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד לבין שאר החומרים הנמצאים במבחנה. על מנת שנוכל לעשות זאת נשתמש בצנטריפוגה שהיא מכשיר המפריד חומרים על פי צפיפותם. ככל שלחומר צפיפות גדולה יותר, הוא כבד יותר ולכן ישקע לחלק התחתון של המבחנה. אצלנו המשקע התחתון יהיה תאי החיידקים הרצויים כיוון שצפיפותם היא הגדולה ביותר. כך נוכל לאסוף אותם בקלות ולהמשיך איתם בניסוי.

4. פיצוץ תאי החיידקים:

כך נוציא את החומרים בתא החיידק ונוכל לאסוף אותם.

אנו נפוצץ את תאי החיידקים בעזרת תמיסת פיצוץ BugBuster, תמיסה זו מפרקת את דופן תא החיידק והיא מכילה מספר מרכיבים המסייעים לפירוק חלקי התא:

ליזוזים: אנזים המפרק את דופן תא החיידק.

דטרגנט: מפרק את הקרום הפוספוליפידי.

נוקלאזות: אנזימים המפרקים DNA וRNA וזאת על מנת לקבל חלבון נקי מה שיצור תמיסה צלולה.

PIC: בתא החיידק קיימים אנזימים המפרקים חלבונים הקרואים פרוטאזות, על מנת שאנזימים אלו לא יהרסו את PON1 נוסיף מעכבים לפרוטאזות אלו.

5. סרכוז נוסף בצנטריפוגה:

נפריד בין שברי הקרומים לחלבונים המסונתזים.

בשלב זה נשתמש שוב בצנטריפוגה על מנת להפריד חומרים בעלי צפיפות שונה. הפעם בשלב זה נרצה לאסוף את הנוזל העליון של המבחנה (ליזט) שמכיל בתוכו את החלבונים השונים שהופקו בתא, ובהם ישנו את הPON1.

6. ניקוי החלבון בעזרת קולונת ניקל:

נפריד בין PON1 לשאר החלבונים שסונתזו בתאי החיידקים.

לאחר שאספנו את מגוון החלבונים שבליזט נרצה לאסוף רק את PON1 ועל מנת שנוכל לעשות זאת נשתמש בקולונת זיקה מסוג קולונת ניקל. לקולונת ניקל זיקה חזקה לחומצת האמינו היסטידין ולכן תיקשר אלייה בקלות.

ההפרדה בין PON1 לשאר החלבונים תתבצע בצורה הבאה: הPON1 עבר ברמת הDNA איחוי עם פפטיד הכולל רצף של 8 היסטדינים שתאפשר משיכה חזקה בין המולקולה החלבונית לחרוזי הניקל.

לשימוש בקולונת הניקל שני שלבים:

ראשית, נשתמש בבופר שטיפה המכיל ריכוז נמוך של אימידאזול אשר נקשר הצורה טובה לחרוזי הניקל ומשמש לשטיפת חרוזי הניקל והרחקת החלבונים שאינם נקשרים באופן ספציפי, כלומר, פינוי של חלבונים לא רצויים שעלולים להיקשר בטעות לחרוזי הניקל בעת השטיפה הראשונה.

שנית, נשתמש בבופר מיצוי המכיל ריכוז גבוה של אימידאזול המשמש למיצוי החלבון PON1 שנקשר לחרוזי הניקל באופן ספציפי על ידי הדחתו מהחרוזים כיוון שהוא (האימידאזול) נמשך אליהם (חרוזי הניקל) בצורה טובה יותר.

לאחר מכן נשאר עם הPON1 נקי יחסית.

7. בדיקת כמות חלבון בשיטת ברדפורד:

נבדוק כמה PON1 נוצר לנו בניסוי.

בשלב זה נשתמש בספקטרופוטומטר על מנת שנוכל לדעת את ריכוז החלבון שנוצר לנו.

נכניס לקיווטת הבלאנק כמות ידועה של מים מזוקקים ותמיסת ברדפורד כדי לאפס את קריאת המכשיר באורך גל של 595nm. קיווטה זו לא תכיל את הPON1 ומטרתה היא אך ורק לאפס את הספקטרופוטומטר על מנת שנוכל למדוד בצורה טובה את רמות הבליעה של כל המבחנות באורך גל זה.

בשלב שלאחר מכן, נעביר לקיווטה נקייה נפח ידוע של מים מזוקקים ונוסיף נוזל המכיל את הPON1 ונערבב היטב. נוסיף לקיווטה זו את הנפח הקבוע של תמיסת ברדפורד ונקרא את הבליעה בספקטרופוטומטר באורך גל של 595nm.

את ריכוז החלבון נקבע על ידי שימוש בנוחסה הנתונה של מכון וייצמן של Y=0.3264X, כאשר Y הוא ערך הOD (בליעה אופטית) וX הוא ריכוז החלבון במיליגרם למיליליטר (mg/mi)

8. קביעת קינטיקה בנוכחות מעכב:

נבדוק את השפעת ריכוז המעכב על פעילותו של PON1.

בשלב זה נכניס לבאריות שונות ריכוזי PON1 זהים, תמיסת פאראוקסון בריכוזים זהים וריכוזי מעכב תחרותי 2HydroxyQuinoline שונים. נמדוד את השינוי בריכוז הPNP בבאריות לפי רמת הבליעה של האור באורך גל של 405nm ונקבל את תוצאות השינוי לפי זמן.

נשתמש בplate reader על מנת לראות את השינוי בריכוז הPNP, זהו מכשיר שהוא ספקטרופוטומטר משוכלל הקורא רמת בעילה במהירות של דוגמות רבות לאורך זמן ומספק תוצאות.

בשלב זה נוכל על פי התוצאות לראות את השפעת המעכב התחרותי על רמת הפעילות של PON1 לריכוזים השונים.

טבלת כלים וחומרים: https://docs.google.com/document/d/1WRHfaY8mKZYmON48CzQATIbPofAVlZ6Zp4feczjxgLc/edit

תוצאות הברדפורד


בשלב קולונת הניקל, לאחר הפקת כלל חלבוני התא אנו רוצים להפריד את PON1 משאר החלבונים ביעילות רבה ככל הניתן. לשם כך תחילה נכניס לקולונה את תמיסת החלבונים ואת בופר השטיפה ומהקולונה יפלטו למבחנת הflow through החלבונים בעליי ההיקשרות הנמוכה לחרוזיי הניקל (לPON1 ההיקשרות הטובה ביותר ולכן לא אמור להיפלט). לאחר מכן אנו נוסיף מיליליטר אחד של בופר שטיפה ונזרים למבחנות אפנדורף מסומנות וזאת על מנת להמשיך בניקוי וניסיון להשאיר כמה שיותר PON1 וכמה שפחות חלבונים אחרים (נבצע זאת 5 פעמים). לבסוף, לאחר השטיפות נכניס 0.5 מיליליטר בופר אילוציה (הדחה) לקולונה בכל פעם על מנת שהחלבונים שנותרו בקולונה יופרדו מחרוזי הניקל ויוזרמו למבחנות אפנדורף שונות לאחר כל עצירה של הטפטוף וככה נישאר עם 5 מבחנות המכילות בעיקר PON1 בריכוזים שונים.

לאחר שנותרנו עם חמשת המבחנות המכילות ריכוזים שונים של PON1 וכעת נרצה לברר מהם ריכוזים אלו עלמנת שנוכל להמשיך עם הריכוז שמתאים לניסוי שלנו (מעל 0.2 מ"ג/מ"ל). על מנת שנוכל לעשות זאת ניקח דוגמה של 5 מיקרוליטר מכל מבחנת אפנדורף ונוסיף אותן לקיווטות נפרדות המכילות 995 מיקרוליטר ריאגנט ובמבחנת הבלאנק נוסיף לריאגנט באותו הנפח 5 מיקרוליטר בופר אילוציה. את קיווטות אלו הכנסנו לספקטרופוטומטר ובדקנו את רמת הבליעה שלהן שאותה הצבנו במשוואת עקומת הכיול שניתנה לנו ומצאנו את ריכוזן. הריכוז הגבוה ביותר (והיחיד שהיה מעל 0.2 מ"ג/מ"ל) היה 0.343 מ"ג/מ"ל והוא היה במבחנת E2, כלומר, בהדחה השנייה.


את החישובים למציאת הריכוז לפי רמת הבליעה נמצא בעזרת משוואת הישר של עקומת הכיול שניתנה לנו והיא y=0.3264x כשהy היא רמת הבליעה בO.D וx הוא הריכוז במ"ג למ"ל. כיוון שיש לנו רמות בליעה שונות בO.D נוכל למצוא את הריכוז בעזרת חלוקת רמת הבליעה ב0.3264 לפי הנוסחה.

על מנת שנמצא את הכמות הכוללת של החלבון שיוצר והופק לנו נוכל לחשב בעזרת הריכוזים והכמויות של החלבון שבטבלה. כמות היא ריכוז כפול נפח, וכיוון שהנפח הכולל שלנו ידוע והוא 2.5 מ"ל וסכום הריכוזים שלנו בכל המבחנות ידוע והוא 0.604 נוכל להכפילם ולקבל שכמות החלבון שהפקנו היא 1.51 מ"ג.

טבלת הריכוז ורמת הבליעה בכל מבחנה

Big image

תוצאות ניסוי החקר

לאחר בדיקת הריכוזים בשיטת הברדפורד, לקחנו את המבחנה שהכילה את הריכוז הגבוה ביותר של חלבונים, ממנה הכנו נפח גדול יותר (750 מיקרוליטר) בריכוז 0.2 מ"ג למ"ל ובנוסף לכך הכנו את ריכוזי המעכב התחרותי הדרושים לניסוי . הכנסנו לplate reader את החלבונים ל16 באריות כשבכל בארית 45 מיקרוליטר ולכל בארית כזאת הוספנו 45 מיקרוליטר מעכב תחרותי בריכוז הרצוי כך שיש כל ריכוז בשתי באריות (באריות אלו מקבילות אחת לשנייה בשורות שונות) וזאת על מנת לקיים חזרה.

מכאן לאחר המדידה קיבלנו את התוצאות הגולמיות בשתי טבלות (לכל שורה, כלומר, לכל חזרה):

https://docs.google.com/spreadsheets/d/1FG_Wa4hDTa6yLs2czWbPO3pIXTf_vxiQz5jo6Mgte00/edit#gid=0


https://docs.google.com/spreadsheets/d/1hdmiTSQfFNnfbCqO9Ii7CGMMDn6oCm5gV_guVgQvUY4/edit#gid=0


לאחר ניתוח התוצאות הגולמיות, הצבנו את הנתונים בגרף שיראה לנו את השפעת ריכוז המעכב התחרותי על ריכוז הPNP שהוא תוצר הפירוק של הפאראוקסון לפי זמן.

גרף לשורה A

Big image

גרף לשורה B

Big image
לאחר בניית הגרפים הללו, הוצאנו את משוואת הקו הישר של כל גרף, הR בריבוע ושיפוע הגרף. לאחר מכן, בעזרת כל השיפועים בנינו גרפים חדשים של מהירות הפירוק (או השיפוע) בריכוזים שונים (Vi) חלקיי מהירות הפירוק ללא המעכב התחרותי (V0). זאת על מנת שבעזרת גרפים אלו נוכל לראות את ההשפעה של המעכב התחרותי ביחס למצב בו אין כזה.

יצרנו שני גרפים של Vi/V0 ולא גרף אחד הנובע ממוצע של כל הנקודות וזאת מסיבה עיקרית אחת: כשאר יש לנו שני גרפים, בניגוד לגרף ממוצעים של נקודות אפשר לראות בעין האם היו טעויות בנקודות מסויימות, את רמת ההתאמה של תוצאות כל חזרה וכך לדעתנו יש להציג את תוצאות אלו על מנת שיתמכו במידת ההצלחה של הניסוי.

השפעת ריכוזים שונים של 2HQ על Vi/V0 בוריאנט WT (בשורה A)

Big image

השפעת ריכוזים שונים של 2HQ על Vi/V0 בוריאנט WT (בשורה B)

Big image

דיון בתוצאות הניסוי ומסקנות

התוצאות שקיבלנו בשיטת הברדפורד הראו לנו מהו ריכוז החלבונים שיצא לנו בכל מבחנת אפנדורף וזאת על מנת שנוכל ליצור ריכוזים מתאימים שאיתם נמשיך לשלב הניסוי עצמו. לקחנו רק את מבחנת E2 כיוון שרק בה היה ריכוז חלבונים שהיה מעל 0.2 מילימולר וזאת על מנת ליצור מבחנה עם ריכוז זה שבעזרתה נבצע את הניסוי כיוון שיצירת ריכוז זה חשובה על מנת שתוצאות הניסוי יהיו ברורות וניתן יהיה לנתחן ולהסיק מסקנות בקלות יחסית.

מהplate reader קיבלנו תוצאות גולמיות בצורת קובץ Excel שבו קיבלנו את תוצאות המדידה של כל בארית ובארית מה שכמובן לא היינו צריכים כי הניסוי התרחש רק בבאריות של השורות A וB. מתוצאות גולמיות אלו לקחנו את התוצאות של הבאריות הרצויות ומהן הכנו גרף של רמת הבליעה כתלות בזמן לריכוזים השונים, פעם בשורה A ופעם בשורה B. כמו כן הכנו מהגרפים הקודמים גרפים של מהירות הפירוק לריכוזים השונים (שיפוע הגרפים) חלקיי מהירות הפירוק ללא מעכב תחרותי.

בתוצאות ניתן לראות כי ככל שמגדילים את ריכוז המעכב התחרותי, כך האנזים מעוכב יותר ופעילותו נפגעת. בארבעת הריכוזים הראשונים (0,2.5,5,10 מיקרומולר) אין הבדל גדול ברמת הפעילות של האנזים, כלומר, בריכוזים קטנים של מעכב תחרותי האנזים מעוכב במידה קטנה יחסית. לאחר מכן בארבעת הריכוזים הגדולים (25,50,100,200 מיקרומולר) יש שינוי ניכר בעיכוב של האנזים, שכפי ששיערנו גדל יחד עם הריכוז הגדל של המעכב התחרותי.

ניתוח הגרפים אישש את השערתנו שלפיה ככל שיגדל ריכוז המעכב התחרותי כך יעוכב הוריאנט WT של PON1 במידה גדולה יותר, מה שיאט את קצב הפירוק של הפאראוקסון לPNP וזאת כמובן רק בטווח הריכוזים שבהם השתמשנו בניסוי שלנו.

גרפי הVi/V0 מראים לנו את היחס בין רמת הפעילות של האנזים (PON1) בנוכחות ריכוזים שונים של מעכב תחרותי מסוג 2HQ ובין מצב בו כלל אין מעכב. מכאן יוצא גרף שמראה לנו ביעילות האם ובאילו ריכוזי מעכב תחרותי תהיה השפעה אמיתית על רמת הפעילות של האנזים.

מגרפים אלו שיצרנו ניתן להסיק כי בריכוזי מעכב תחרותי נמוכים יחסית (0,2.5,5,10 מיקרומולר) ישנו עיכוב נמוך יחסית של האנזים ואילו בריכוזים הגבוהים יותר (25,50,100,200 מיקרומולר) יהיה עיכוב משמעותי שניתן לראות בבירור בגרף.

עוד תכונה של הגרפים החדשים שיצרנו היא שהיא כבר מציגה לנו את רמת הפעילות ביחס לריכוז המעכב בניגוד לגרפים הראשונים שבהם הריכוז ממש ידוע אבל אין קשר בין שינויי הריכוזים לרמות הפעילות. לכן מגרפים אלו ממש ניתן להוציא מגמות הקשורות בריכוז מעכב תחרותי והשפעתו על רמת פעילות.

התייחסות לתוצאות קבוצת המחקר

את התוצאות שהן גרפי הVi/V0 של שאר חברי קבוצת המחקר, כלומר הצוותים בעלי אותה שאלת חקר שבוצעה בוריאנטים שונים של PON1 שהם 8C8 וH115W. הכנסנו את כל גרפים אלו למערכת צירים אחת על מנת להשוות ביניהם ולהסיק מסקנות על הוריאנט של הניסוי שלנו, WT, ביחס לשאר הוריאנטים.

בניגוד לגרפים אלו בניסוי שלנו כן יצרנו ממוצע משתי סיבות:

1. ראינו כי יש דמיון רב בין שני הגרפים שלנו ועל כן אין חשש לאיבוד נתונים או לסטיות שישנו את המגמה באופן משמעותי.

2. רצינו להציג כמה שפחות גרפים כדי לראות רק את מגמות הגרפים ולהסיק מסקנות.

הגרף שהתקבל לקבוצת המחקר

Big image
לאחר יצירת גרפים אלו ופיענוחם ניתן להסיק מסקנות לגבי כל הוריאנטים.

ראשית ניתן לראות כי גרפי הוריאנטים H115W ו8C8 הם כמעט ישרים לחלוטין ומשמעות עובדה זו היא שוריאנטים אלו כמעט ולא מעוכבים על ידי המעכב התחרותי 2HydroxiQuinoline ולכן כל רמות הפעילות של שני אנזימים אלו בנוכחות ריכוזים שונים של המעכב התחרותי לא יעוכבו. לכן כל ערכיי הVi/V0 יתנו ערך הקרוב ל-1 (ולא אחת כי אין תוצאות "מושלמות").

בניגוד לכך בוריאנט WT ישנו עיכוב ולכן ניתן לראות כי הגרף אינו לינארי וככל שריכוז המעכב התחרותי יעלה, כך רמת הפעילות בריכוז מעכב חלקיי רמת הפעילות ללא מעכב תקטן ואת מהסיבה שפירטנו מוקדם יותר.

הסבר לעיכוב של WT לעומת שאר הוריאנטים

מתוצאות הניסוי ראינו שרק הוריאנט WT של PON1 יעוכב על ידי המעכב התחרותי 2HQ בניגוד לשני הוריאנטים האחרים.

ובכן, כיצד ניתן להסביר זאת?

הוריאנטים השונים נבדלים אחד מהשני בסוגי המוטציות, מיקומן וכמותן ברצף חומצות האמינו באנזים. לוריאנט WT אין מוטציות, לוריאנט H115W יש את מוטצית הH115W ולוריאנט 8C8 ישנן שלוש מוטציות: H115W, L69S, F222S.

המשותף בין הוריאנט 8C8 וH115W היא המוטציה H115W ומשמעותה היא שבחומצת האמינו במקום ה115 הוחלפה חומצת האמינו היסטידין- H בחומצת האמינו טריפטופן- W. שהיא כאמור מוטציה שקיימת בשני הוריאנטים שלא עוכבו אך לא קיימת בוריאנט שכן עוכב.

ומה הקשר בין שינוי ההיסטידין לטריפטופן לחוסר העיכוב של הוריאנטים בעלי המוטציה?

כפי שניתן לראות ישנו דימיון בין מולקולת ההיסטידין למולקולת הטריפטופן אך ההבדל המשמעותי ביותר הוא תוספת הטבעת בקצה מולקולת הטריפטופן שמוסיף מאד לגודל המולקולה.

כיוון שהשינוי מחומצת האמינו של ההיסטידין לטריפטופן ממוקם באתר הפעיל שאחראי בין היתר לעיכוב המולקולה בעת היקשרות המעכב התחרותי 2HQ ומולקולת הטריפטופן כפי שאמרנו גדולה ממולקולת ההיסטידין היא גם תופסת יותר מקום ומשנה את המבנה המרחבי של האתר הפעיל אך מוטציה זו גם גורמת לגדילת המרחק בין שני יוני הסידן במולקולה (הקטליטי והמבני) ובכך גורמת לשינוי המבנה המרחבי של המולקולה באתר הפעיל ולא מאפשרת היקשרות ל2HQ ולכן הוריאנטים H115W ו8C8 שבהם ישנו שינוי זה לא יעוכבו בניגוד לWT בו אין את השינוי ולכן כן יעוכב.

נספחים:

מכון וייצמן

קישור לכרטיס ביקור למכון ויצמן: https://docs.google.com/document/d/1VH2lgkqlvjBQAZrzeeilwoI5pNH6p0_loz06m2MfiNY/edit

תשובות למאמר המרכזי