פרויקט ביוטק 2016

שמות המבצעים: ברק נויברגר ועידו גרובר י"א 2

מהי ההשפעה של ריכוזים שונים של מעכב תחרותי על רמת הפעילות של הווריאנט 8C8 של PON1?

שמות המנחים: גדי ערמוני, ירדנה דוד ורופאידה מרוואת

שם המורה: ענת קפלן

תיכון: "הדרים" הוד השרון

בחסות: מכון ויצמן

מבוא למחקר ותיאורו

כמה דברים שצריך לדעת לפני שניכנס לשאלת החקר:

גז עצבים: גז העצבים הוא כחומר לחימה כימי (נשק להשמדה המונית - נשק לא קונבנציונלי). גז העצבים הוא תרכובת אורגנו זרחתית, שמשבשת את פעילותו של האנזים אצטילכולין אסטראז בכך שהיא נקשרת לאתר הפעיל שלו בקשרים קוולנטים חזקים (מעכב בלתי הפיך - משנה את המבנה המרחבי של האנזים ובכך הורס את פעילותו).

גז העצבים הוא חסר טעם וריח בטמפרטורת החדר, וכאשר נחשפים אליו ישנם פרכוסים ועוויתות, אי שליטה על הסוגרים, הפרשת רוק, דמעות, זיעה, הרפיה כללית והרפיית השרירים ולבסוף - מוות.

מדוע זה קורה?

אצטילכולין - נוירוטרנסמיטר שאחראי על התכווצות שריר השלד, הרפיית שרירי הלב והפרשת תוצרי בלוטה. על מנת שיתרחש איזון בין הגירוי לבין התגובה, אצטילכולין צריך "להסתלק" מן הקולטנים - האנזים אצטילכולין אסטראז מפרק את האצטיכולין למרכיביו (אצטיל+כולין), ובכך תא המטרה מפסיק להיות מופעל.

בעת החשיפה לגז העצבים, מולקולות גז העצבים נקשרות למולקולות האנזים אצטילכולין אסטראז, ובכך מונעות ממנו את היכולת לפרק את האצטליכולין למרכיביו, ולכן, תאי המטרה ממשיכים לפעול בלי קשר לגירוי הראשוני. (ומשם כל התסמינים).

איך מטפלים בזה והאם אפשר בכלל?

הטיפול שקיים כיום נגד גז העצבים הוא אטרופין (מצוי בצמח האטרופה ממשפחת הסולנים - כיום הוא מסונתז במעבדה). האטרופין נקשר לקולטנים של האצטיכולין, ולכן פעילותו של האצטיכולין מצטמצמת ותאי המטרה יפעלו בעוצמתיות נמוכה יותר. החיסרון של השימוש בו, שהוא גורם לנזק נוירולוגי מסוים, וחשוב לקחת אותו במינון מתאים (יכול לגרום לאיבוד הכרה).

למה אנחנו מספרים לכם את כל זה?

כיום, מפתחים טיפול חדשני ויעיל יותר מהאטרופין בעת חשיפה לגז עצבים. טיפול זה, שהוא בעצם אנזים, נקרא PON1.

PON1 הוא אנזים המסוגל לפרק כמה סובסטרטים שונים וביניהם: לקטון, אסטרים, מעכב חמצון של LDL ונקשר ל - HDL, והתפקיד החשוב ביותר (לנו כמובן) - פירוק תרכובות אורגנו זרחתיות, למשל גז העצבים.

אתם בטח שואלים את עצמכם, למה הטיפול החדשני הזה, טוב יותר מאטרופין?

ובכן, להשתמשות בPON1 כטיפול, יש כמה יתרונות על פני הטיפול באטרופין והם:

אטרופין גורם לנזק נוירולוגי מסוים בעוד PON1 לא ידחה על ידי המערכת החיסונית משום שהוא נמצא כבר בגוף (מופרש מהכבד אל סרום הדם בכמויות קטנות ואף מזעריות), ומשום כך לא יגרום נזק לגופינו בדרך כלשהי. נוסף על כך, ישנו יתרון כלכלי בשימוש בPON1 (על פני האטרופין) - אנזים אינו משתנה במהלך תגובה אנזימטית ולכן הוא יכול לפעול פעמים רבות, ולכן ידרשו מינונים נמוכים יחסית לאטרופין. ולבסוף, PON1 מטפל בשורש הבעיה לעומת האטרופין שמצמצם את עוצמתם של התסמינים בעקבות החשיפה לגז העצבים (בלבד!)

אנו עורכים השנה את פרויקט הביוטק שלנו, במכון ויצמן למדע ברחובות. במהלך השיעורים בבית הספר בביוטכנולוגיה, הצטרכנו לבחור כיצד נחקור את האנזים PON1 (כלומר בווריאנטים שונים של האנזים, לווא דווקא האנזים המקורי), בהיבט אחד מתוך שניים שניתנו לנו: רמת הפעילות של האנזים, או רמת הביטוי של האנזים. במחקרנו, בחרנו לחקור את רמת הפעילות של האנזים, ומכאן, יצאה שאלת החקר שלנו: מהי ההשפעה של ריכוזים שונים של מעכב תחרותי על רמת הפעילות של הווריאנט 8C8 של האנזים PON1? כל זאת ועוד, בהמשך הפוסטר.

השערה

אנו חושבים כי המעכב התחרותי 2HQ לא ישפיע כלל על רמת פעילותו של האנזים PON1 בווריאנט 8C8

משתנה בלתי תלוי: ריכוז המעכב התחרותי - 2Hydroxy Quinoline, ניצור ריכוזים שונים של המעכב בעזרת שיטת המיהולים (הריכוזים הם - 0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100, 200 במיקרומולר)

משתנה תלוי: רמת הפעילות של הווריאנט 8C8 של PON1, אותו נמדוד בעזרת מכשיר הPLATE READER (נמדוד את רמת הבליעה של PNP שהוא תוצר הפירוק של פראוקסון - אנלוג לגז עצבים)

הניסוי המקדים

למה צריך ניסוי מקדים?

הניסוי המקדים הכרחי על מנת שבניסוי החקר תהיה כמות מספקת של PON1 שנוכל להשתמש בה. בניסוי המקדים, נכין חיידקים המכילים את הגן ל-PON1 בשיטה של הנדסה גנטית. הניסוי המקדים מתחלק לשני חלקים:

1. טרנספורמציה - בשלב זה נחדיר פלסמיד עם הגן המקודד ל - PON1 מווריאנט 8C8 , גן המקודד לעמידות אמפיצילין ורצף נוקליאוטידים שחיוני לשכפול הפלסמיד בתוך תא החיידק (ORI). נוסף על כך, בפלסמיד יהיה גם מקטעי DNA (אופרון הלקטוז המהונדס) שתפקידם יהיה לגרום לתא החיידק לסנתז את PON1 בווריאנט שבחרנו בצורה לא מבוקרת (מקטעי I P O ואחריו גן המקודד לווריאנט 8C8 של PON1). לאחר הגן המקודד לPON1, יהיה גן המקודד ל8 חומצות אמיניות היסטידין (8HIS), שמחובר לגן המקודד לPON1. נכין 2 מבחנות - מבחנת ניסוי שתכיל את הפלסמיד הרקומביננטי, חיידקים, יוני סידן ומצע גידול נוזלי LB, ומבחנת בקרה שתכיל את הכל חוץ מהפלסמידים. תפקיד יוני הסידן הוא לגשר בין המטען השלילי של הפלסמיד (בגלל קבוצת הזרחה) והמטען השלילי של קרום תא החיידק, מה שיגרום לכך שלא תהיה דחיה חשמלית ביניהם. נוסף על כך, עוד דרך להגדיל את סיכוי קליטת הפלסמיד אל תא החיידק היא שוק טרמי: קרח, 42 מעלות צלזיוס, קרח, 37 מעלות צלזיוס - מה שיגרום להרחבת הנקבוביות בקרום תא החיידק.

2. ברירת החיידקים שקיבלו את הפלסמיד - בשלב זה נברור בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד לבין אלו שלא קלטו אותו, בעזרת אמפיצלין (החיידקים שקיבלו את הפלסמיד ישרדו משום שיש על הפלסמיד גן שמקודד ליצירת אנזים שמפרק את האמפיצילין). נכין 3 צלחות פטרי:

1. צלחת פטרי עם מצע גידול אגר (מוצק) ואמפיצלין - בה נוסיף את החיידקים ממבחנת הניסוי, על מנת לברור בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד לאלו שלא.

2. צלחת פטרי עם מצע גידול אגר (מוצק) ואמפיצילין - בה נוסיף את החיידקים ממבחנת הבקרה, על מנת לוודא שלחיידקים אין עמידות טבעית לאמפיצילין.

3. צלחת פטרי עם מצע גידול אגר (מוצק) - בה נוסיף את החיידקים ממבחנת הבקרה, כדי לוודא ששום דבר אחר (מלבד האמפיצלין) הרג את החיידקים (כמו טמפרטורה).


משתנים:

המשתנה הבלתי תלוי - החיידקים אשר קלטו את הפלסמיד הרקומביננטי. משתנה בלתי תלוי נוסף, הינו סוג מצע הגידול (החומרים שמצע הגידול מכיל, לדוגמה - אגר+אמפיצלין).

המשתנה התלוי - מספר מושבות החיידקים בצלחת הפטרי.

תוצאות הניסוי המקדים

טבלת תוצאות הניסוי המקדים

Big image
Big image

דיון בתוצאות הניסוי המקדים

על מנת להתחיל את ניסוי החקר, ערכנו ניסוי מקדים בו הכנו את החיידקים המכילים את הגן לPON1 ל8C8 (למרות שבסופו של דבר לא השתמשנו בניסוי המקדים שאנחנו ערכנו…).


בצלחת הראשונה, התקבלה מושבת חיידקים אחת - מה שמראה שרק אחוז קטן מן החיידקים קלט את הפלסמיד (משום שאלו שלא קלטו אותו אין להם עמידות לאמפיצלין, משמע הם "נהרגו" על ידי האמפיצילין).

בצלחת השנייה, התקבלו 0 מושבות חיידקים - מה שמראה שלחיידקים אין עמידות לאמפיצילין מטבעם, כי אם הייתה להם הם היו שורדים. צלחת זו היא הבקרה השלילית.

בצלחת השלישית, התקבלו מושבות רבות של חיידקים (מרבד של חיידקים) - מה שמראה כי אין דבר שהרג את החיידקים במהלך הניסוי מלבד האמפיצילין וחוסר עמידותם אל האנטיביוטיקה. בצלחת זו היו גם חיידקים שלא קלטו את הפלסמיד וגם חיידקים טרנסגנים שכן קלטו את הפלסמיד. נוסף על כך, צלחת זו היא בקרה חיובית.

טבלאות של שיטות העבודה של הניסוי המקדים וגם של ניסוי המחקר (חומרים וכלים) -

https://docs.google.com/document/d/1AH9JL0jwC3SB109Zws0IQrXqK4pS9bzwzTxstDEIZ0s/edit

מהלך המחקר

המחקר שלנו מורכב מכמה שלבים עיקריים, שאולי נראים מסובכים במבט ראשון, אך ההסבר שאנו נותנים יהיה מובן ומוסבר היטב, כך שאין דאגה....

להלן מהלך המחקר:

1. גידול החיידקים (בקנה מידה גדול) עד אמצע השלב הלוגריתמי - מטרת שיטה זו היא קבלת כמות מספקת של חיידקים שהם עדיין אנרגטיים ומסוגלים לסנתז את PON1 בהמשך. בשלב זה של הניסוי אנו נגדל חיידקים שקלטו פלסמיד המכיל את הטרנסגן פלסמיד המכיל את הטרנסגן (8C8) בכמה שלבים:

לוקחים דגימה של חיידיקם טרנסגנים מצלחת הניסוי של הניסוי המקדים. לאחר מכן, מכניסים את החיידקים לארלנמייר (המכיל מצע גידול נוזלי (LB) ). למצע הגידול מוסיפים אמפיצילין, על מנת שחיידקים שנמצאים בסביבה החיצונית לא יזהמו את מערכת הגידול. אחרי כן, מטלטלים את בקבוק הארלנמייר במטרה להגדיל את שטח הפנים לחדירת חמצן. ולבסוף, לוקחים דגימת חיידקים ובודקים את רמת הבליעה בספקטרופוטומטר באורך גל של 600 ננומטר. כאשר רמת הבליעה מגיעה ל0.6 - 0.8 OD מפסיקים את גידולם. אנו נעבוד עם מבחנת בלאנק שתכיל רק את מצע הגידול הנוזלי, משום שגם מצע גידול בולע אור, ואנו רוצים לדעת רק את רמת הבליעה של החיידקים ולכן נקזז את רמת הבליעה של מצע הגידול בעזרת מבחנת הבלאנק.

2. הוספת IPTG - מטרת שיטה זו היא שהחיידקים יבטאו את הגן ל PON1 בווריאנט שבחרנו (8C8) תחת בקרת אופרון הלקטוז. בשלב זה נפיק PON1 בעזרת IPTG - לחומר זה, שנקרא משרן ודומה מאוד ללקטוז, יש שני יתרונות על הלקטוז בשימושו בניסוי שלנו:

- הוא לא מפורק על ידי החיידק (כמו הלקטוז שיפורק על ידי האנזים בטא גלקטוזידאז)

- הוא נכנס בקלות אל תא החיידק (בדיפוזיה אל התא).

מטרת הוספת הIPTG, היא היקשרות אל הדכאן וניטרולו. כאשר הIPTG נקשר אל הדכאן, הוא מנטרל אותו ובעקבות זאת, נוצר mRNA שעובר תרגום לPON1 בווריאנט שבחרנו (8C8). אופרון הלקטוז המהונדס, אותו נחדיר לפלסמיד הרקומביננטי, שונה מאופרון הלקטוז הטבעי בכך שאין לו את הגנים שמקודדים לאנזימים שונים שגורמים לניצולו של הלקטוז, אלא ישנו גן המקודד לPON1 בווריאנט 8C8 (הווריאנט הספציפי שבחרנו).

3. צנטריפוגה - מטרת שיטה זו היא הפרדת החיידקים ממצע הגידול. הצנטריפוגה היא מכשיר להפרדת חומרים על פי צפיפותם. ככל שחומר הוא בעל צפיפות גדולה יותר, הוא כבד יותר, ולכן, מצטבר קרוב יותר לתחתית המבחנה. לאחר שלב זה של שימוש בצנטריפוגה, נמשיך עם המקטע התחתון של המבחנה (זהו המקטע המכיל את משקע החיידקים שלנו = PELET).

4. פיצוץ החיידקים בעזרת תמיסת BUGBUSTER - מטרת שיטה זו היא פיצוץ תאי החיידקים על מנת שנוכל להגיע לPON1 המצוי בתוך תא החיידק הטרנסגני.

תמיסת הפיצוץ היא תמיסה המכילה ארבעה מרכיבים עיקריים:

- ליזוזים - אנזים שתפקידו לפרק את דופן תא החיידק

- דטרגנט - מפרק את המרכיב השומני של קרום התא (=המרכיב הפוספיליפידי)

- נוקליאזות - אנזימים שמפרקים DNA ו - RNA ומטרתם להפוך את התמיסה לצלולה ולא צמיגה (דוגמאות לכך הן BENZONASE שם קצת יוצא דופן וקצת בוטה, אבל נחיה עם זה ועוד כגון - DNAseI)

- PIC - קוקטיל של מעכבי פרוטאזות - אנזימים שנמצאים בתא החיידק שמפרקים חלבונים (=פרוטאזות). על מנת שהם לא יפרקו לנו את מוצר הדגל, PON1, אנו נוסיף את הקוקטיל - שיעכב את פעילות האנזימים הללו, וכך לא יתפרק PON1.

5. סרכוז נוסף בצנטריפוגה האהובה שלנו - מטרת שיטה זו היא הפרדת שברי הקרומים לבין החלבונים שסינתזו החיידקים. לאחר סרכוז זה, נמשיך עם המקטע העליון של המבחנה, משום שלחלבונים צפיפות נמוכה יותר מן שברי הקרומים.

6. ניקוי החלבון בעזרת קולונת ניקל - מטרת שיטה זו היא הפרדת PON1 לבין שאר החלבונים שסינתזו החיידקים ומצויים כולם בליזט (=המקטע העליון של המבחנה). בשלב זה, נרצה להפריד את PON1 משאר החלבונים שמבוטאים בחיידק, נעשית הפרדה זו בעזרת קולונת זיקה מסוג ניקל. לפלסמיד הרקומביננטי הוספנו כזכור מקטע DNA שיש בו את הקוד הגנטי ליצירת 8 HIS. חלק ממבחנה מולקולת ההיסטידין היא טבעת אימידוזולית. ליון הניקל, יש זיקה חזקה מאוד לטבעת זו. התוספת של 8 HIS מאפשרת להעניק לחלבון PON1 יתרון בקישור לניקל.
בשיטה זו נשתמש בשני בופרים:

1. בופר שטיפה - בריכוז נמוך של אימידאזול (20 מילימולר). מטרת בופר זה היא שהחלבונים האחרים ישטפו החוצה (בגלל זיקה חלשה לטבעת האימידאזולית לא כמו PON1 המהונדס שלנו) , וPON1 יקשר לחרוזי הניקל.

2. בופר אלוציה (הדחה) - בריכוז גבוה של אימידאזול (500 מילימולר). מטרת בופר זה היא שPON1 שנקשר לחרוזי הניקל, ייפרד מהם, ונקבל לבסוף (בעולם מושלם ובמצב אידיאלי) רק PON1.

7. בדיקת ריכוז החלבון בשיטה ספקטרופוטומטרית עם ריאגנט ברדפורד - מטרת שיטה זו היא בדיקת ריכוז החלבון שקיבלנו. את ריכוזו של החלבון, נקבע באמצעות הצבה במשוואת הקו הישר שהיא עקומת הכיול שניתנה לנו על ידי המנחים במכון ויצמן( Y רמת הבליעה, X ריכוז). בשלב זה נוסיף את ריאגנט ברדפורד שכשהוא מגיב עם החלבון, צבעו משתנה מצהוב-חום לכחול!!! (מי אמר שלא נהנים בביוטכנולוגיה???). רמת הבליעה תימדד באורך גל של 595 ננומולר. יש לציין, כי בהתחלה נשתמש במבחנת בלאנק, שתכיל רק ברדפורד ומים, על מנת לקזז את רמת הבליעה של החומרים הללו, ולבדוק רק את רמת הבליעה של החלבונים.

8. בדיקת רמת הפעילות של הוריאנט שבחרנו 8C8 (כמובן של PON1) - מטרת שיטה זו היא לבדוק עד כמה הווריאנט שבחרנו 8C8 של PON1 פעיל ויעיל בפירוק גז עצבים (לשם כך התכנסו כאן, אנחנו לא סתם עושים ביוטכנולוגיה לכיף, אלא גם לעזור ולתרום לאנושות!). פראוקסון הוא אנלוג לגז עצבים. כדי לבדוק את רמת הפעילות של PON1 בווריאנט שבחרנו 8C8, נשתמש ב PLATE READER שהוא ספקטרופוטומטר משוכלל - הוא קורא במהירות דוגמאות רבות לאורך זמן (הPLATE READER מודד את רמת בליעת האור של תוצר הפירוק של הפראוקסון, PNP). בשלב זה הסובסטרט פראוקסון יפורק על ידי PON1 8C8, ויתקבל תוצר PNP שהוא בעל צבע צהוב, צבע זה ניתן למדידה באורך גל של 405 ננומטר. חשוב לציין, כי בכל בארית בPLATE READR, נוסיף ריכוז של PON1 בווריאנט 8C8 קבוע, ריכוז קבוע של הסובסטרט פראוקסון, וריכוזים שונים (שניצור בעזרת מיהולים) של המעכב התחרותי 2HydroxyQuinoline.

תוצאות- ברדפורד

מיצינו את החלבונים בעזרת קולונת ניקל, בעזרת 10 בופרים - 5 בופר שטיפה ו5 בופר אלוציה (הדחה). להמשך הניסוי, למציאת ריכוז החלבון בעזרת שיטת ברדפורד, לקחנו את 5 המבחנות שמיצינו בעזרת בופר האלוציה והוספנו להם נפח שווה (200 מיקרוליטר) של ריאגנט ברדפוד בכדי שנוכל למדוד את רמת הבליעה של החלבון ובכך- בעזרת הצבה בעקומת הכיול (הצבה בערך הy את רמת הבליעה ובידוד ערך הx שהוא הריכוז) נמצא את הריכוז של החלבון בתמיסה שקיבלנו.
Big image

תוצאות הPLATE READER- טבלת הנתונים הגולמיים

תוצאות הPLATE READER (מעובדות)

Big image
Big image
*Vi - רמת הפעילות של האנזים PON1 בווריאנט 8C8 בהשפעת המעכב 2HQ

Vo - רמת הפעילות של האנזים PON1 בווריאנט 8C8 ללא השפעת מעכב

דיון בתוצאות, מסקנות

בניסוי רצינו לבדוק את רמת הפעילות של האנזים PON1 בווריאנט 8C8 בהשפעת ריכוזים שונים של המעכב התחרותי 2HQ. השערתנו הייתה שהמעכב התחרותי אינו משפיע על רמת פעילותו של הווריאנט שבחרנו, 8C8. במהלך הניסוי, איששנו את השערתנו. ניתן לראות לפי התוצאות, כי רמת פעילותו של הווריאנט לא מושפעת מריכוז המעכב התחרותי כלל בטווח הריכוזים שבחרנו, וזאת ניתן להסביר בכך ששיפוע הגרף (השפעת הריכוז של המעכב התחרותי 2HQ על רמת פעילותו של האנזים PON1 בווריאנט 8C8) קרוב מאוד ל0 - ניתן לראות כי הגרף ישר ומכאן ניתן להסיק שלא קיימת שום השפעה של המעכב על רמת הפעילות. נוסף על כך, ככל שהעלנו את ריכוז המעכב התחרותי 2HQ, רמת הפעילות של הווריאנט שבחרנו לא השתנתה, כך ניתן להסיק כי לא קיימת השפעה של המעכב על רמת הפעילות שלו (בטווח הריכוזים שבחרנו).
בנוסף לכך, ניתן להסיק כי חברת התרופות אכן תרצה להשקיע כסף בייצור ווריאנט זה מכיוון שפעילותו אינו מושפעת (מועכבת) ולכן כאשר יהיה שימוש בגז עצבים בפצצה ויהיה בה גם המעכב התחרותי 2HQ, יוכלו להמשיך ולהשתמש בPON 1 מווריאנט זה מכיוון (כמו שנאמר קודם לכן) הוא אינו מושפע ממעכב תחרותי זה (בריכוזים שנבדקו).

התייחסות לתוצאות של קבוצת המחקר

Big image
במקביל לניסוי שלנו, שבדק את רמת הפעילות של הווריאנט 8C8 של PON1 בנוכחות מעכב תחרותי 2HQ, נבדקו גם ווריאנטים אחרים - על מנת לבדוק איזה ווריאנט יעיל ביותר, מושפע פחות מהמעכב התחרותי, ויכול לפרק את התרכובות האורגנו זרחתיות (ביניהן גז עצבים) בצורה טובה יותר, מהירה יותר, יעילה יותר. הווריאנטים האחרים שנבדקו הם - H115W וWT, כאשר WT הוא כימרה של PON1 מארבעה יצורים - עכבר, חולדה, אדם וארנבת, H115W הוא מוטציה של WT כאשר משנים את החומצה האמינית היסטידין לטריפטופאן במקום ה115. ב8C8 קיימות מוטציות נוספות למוטציה של H115W - חומצה אמינית סרין במקום פנילאנין במקום ה222 וחומצה אמינית סרין במקום לאוצין במקום ה69.

מן התוצאות של קבוצת המחקר ניתן לראות כי רמת הפעילות של PON1 מהווריאנטים H115W ו8C8 לא מושפעת מריכוז המעכב התחרותי- שיפע הגרפים של רמת הפעילות של שני ווריאנטים אלו כתלות בריכוז המעכב התחרותי שאף לאפס, מה שמראה על חוסר תלות, בעוד הגרף של רמת הפעילות של WT כתלות בזמן היה בעל שיפוע שלילי מה שהראה כי ככל שריכוז המעכב התחרותי 2HQ גדל- רמת הפעילות של ווריאנט זה קטן.

ניתן להסיק מתוצאות אלו כי המוטציה H115W היא הגורם לחוסר העיכוב של PON1 על ידי המעכב התחרותי 2HQ מכיוון שזו המוטציה המשותפת לשני הווריאנטים אשר לא עוכבו.
מדוע המוטציה H115W גורמת לכך שלמעכב התחרותי לא תהיה השפעה על רמת הפעילות של PON1?

כדי להסביר זאת קודם נתבונן במבנה של שתי החומצות האמיניות: היסטידין וטריפטופאן (תמונה מצורפת למטה). ניתן לראות בברור כי המבנה המרחבי של טריפטופאן גדול מהמבנה המרחבי של היסטידין. העמדה 115 בPON1 נמצאת התוך האתר הפעיל ולכן כאשר נחליף את החומצה האמינית בעמדה זו -היסטידין (שהיא קטנה יחסית לטריפטופאן) בטריפטופאן, האתר הפעיל של PON1 ישתנה ויגדל. ניתן להסביר את חוסר ההשפעה של המעכב התחרותי על רמת הפעילות של H115W ו8C8 בכך, שכאשר האתר הפעיל ב-PON1 גדל בעקבות החלפת החומצה האמינית בעמדה 115 המעכב התחרותי מאבד את ההתאמה המרחבית שלו לאתר הפעיל של PON1 מכיוון שהמבנה שלו השתנה בעוד גז העצבים עצמו עדיין מתאים מרחבית לאתר הפעיל גם לאחר השינוי במבנה שלו, ולכן שני הווריאנטים הללו לא מעוכבים על ידי המעכב התחרותי 2HQ.

הצעות לשיפור

אם היינו כוללים יותר חזרות בניסוי שלנו, תוצאותיו היו מהימנות יותר, והיו יותר יכולים להתבסס על הניסוי.

אם היינו מיומנים יותר והיינו מתאמנים על מיומנויות המעבדה, היו נוצרות פחות בועות בשלבים השונים של הניסוי (כמו במיהולים למשל), וכך לא הייתה נוצרת דנטורציה של החלבונים (הרס החלבונים), היינו מקבלים יותר חלבון והיה לנו כמות גדולה יותר של חלבון לעבוד איתה.

כיווני המשך

בהתבסס על תוצאות הניסוי שלנו ותוצאות הניסוי של קבוצות המחקר, H115W ו - 8C8 הם הווריאנטים היעילים ביותר לפירוק תרכובות אורגנו - זרחתיות, ביניהן גז עצבים - הם הושפעו הכי פחות מהמעכב התחרותי 2HQ. כך, ניתן לחשוב כי אלו ווריאנטים אופטימלים לשימוש כנגד גז עצבים. למרות זאת, אנו רואים לפי הגרפים ולפי התוצאות, שגם הווריאנטים הללו מעוכבים במידה מסוימת (קטנה מאוד) מריכוז המעכב התחרותי. כך, חשבנו כי ניתן להשתמש בשיטה של אבולוציה מכוונת, וליצור מוטציה חדשה על גבי הPON1 שיגרום לו להתעכב פחות מהמעכב התחרותי, ולפרק את גז העצבים ותרכובות אורגנו - זרחתיות בצורה מקסימלית וטובה. כך, נוכל להשתמש בPON1 עם המוטציה החדשה, כפתרון לחשיפה לגז עצבים.

תודות

אנו מודים לאנשים שעמדו לידנו עד הלום -
גדי ערמוני, שחישב בשבילנו חישובים מסובכים ועזר לנו עם מהלך העבודה במכון ויצמן.
ירדנה דוד שהנחתה אותנו ועזרה לנו בניסוי החקר.
רופאידה מרוואת שהצילה לנו את הניסוי ועזרה לנו רבות בקבלת תוצאות טובות בניסוי החקר.
ולענת קפלן שעזרה, הנחתה אותנו ותרמה לנו והקנתה לנו ידע שעזר לנו לחקור בצורה הטובה ביותר.

תודה לקבוצת המחקר שהביאה לנו תוצאות אמינות ומדויקות שיכולנו להסתמך עליהן (רותם, יובל, עומרי ואלה).

נ.ב. תודה לPON1 בווריאנט 8C8 שעזר לנו להבין שהוא הכי טוב מבין כל הווריאנטים של PON1.