פרויקט ביוטק 2016

מאת: נדב קולבסון ועידו פרג'ון

כיצד משפיע ריכוז האנזים PON1, וריאנט 8C8, על קצב התגובה האנזימטית בזן החיידקים אוריגאמי?

תיכון הדרים יא2 הוד השרון
מנחים במכון ויצמן: גדי ערמוני וירדנה דוד.

מורה: ענת קפלן

בחסות מכון ויצמן

רקע מדעי לנושא המחקר

רקע מדעי: תא העצב מכיל מעין שלפוחיות שבתוכן נויורוטרנסמיטרים, לדוגמה- האצטילכולין אשר יש לו שלושה תאי מטרה: תאי שריר, עצב ובלוטה. על מנת שהאצטילכולין לא ישאר קשור לקולטנים בצורה מתמדת ישנו אנזים אצטילכולין אסטראז אשר מפרק את האצטילכולין למרכיביו. כאשר גז עצבים שהוא תרכובת אורגנוזרחתית אשר גורם לתסמונת האדם הנוזל נכנס אל הגוף הוא נקשר למולקולת האנזים הנ"ל בקשר קוולנטי ובכך מונע ממנו באופן תמידי להיקשר אל מולקולת האצטילכולין ולפרקה וכתוצאה מכך האצטילכולין יהיה קשור באופן קבוע לתאי המטרה ויגרום לפעילותם באופן תמידי. כיום, הטיפול המתאים לגז העצבים הינו אטרופין אשר נקשר לקולטנים של האצטילכולין ובכך פעולתו של האצטילכולין מצטמצמת. טיפול זה אינו יעיל במיוחד מכיוון שהוא אינו מטפל בשורש הבעיה אלא רק מפחית את תסמיניה. כתוצאה מכך, ישנה הצעה להשתמש בPON1 שהוא מולקולה חלבונית שמפרקת תרכובות אורגנוזרחתיות למשל-גז עצבים. החלבון שיסונתז מזן חיידקים שלנו, אוריגאמי, שונה מזה של BL21 בכך שזן האוריגמי שלנו אינו מפרק את קשרי הS-S שבפולימולקולת החלבון, ובכך אינו משנה את מבנה הPON1, לעומת הזן BL21 מפרק את קשרים אילו וכן משנה את המבנה המרחבי של החלבון.

בפרוייקט הביוטק השנה בשיתוף עם מכון וייצמן נבחר לבדוק את רמת הפעילות והביטוי של PON1.
אנו בחרנו לבדוק את שאלת המחקר הבאה: "כיצד משפיע ריכוז האנזים PON1, וריאנט 8C8, על קצב התגובה האנזימטית בזן החיידקים אוריגאמי?"

השערה: ככל שריכוז החלבון PON1, וריאנט 8C8, גדול יותר כך קצב התגובה האנזימטית גדול יותר עד ריכוז אנזים מסויים שבו הסובסטרט יהווה גורם מגביל.

משתנה בלתי תלוי: ריכוז האנזים PON1, נשנה אותו בכך שנמהל את תמיסת האם לריכוזים שונים.

משתנה תלוי: קצב התגובה האנזימטית, נמדוד את רמת הבליעה של PNP ,כתלות בזמן, באמצעות PLATE READER.

גורמים קבועים: ריכוז סובסטרט, טמפרטורה, נפח תמיסת הסובסטרט, נפח תמיסת הPON1, רמת pH של המערכת.

חזרות: בבאריות שהוכנסו לPLATE READER היה קיים דופליקט.


בקרה: פנימית השוואתית- נשנה את ערכי ריכוז הPON1, וריאנט 8C8, מזן חיידקי האוריגמי, ונמדוד את השפעתו, בכל אחד מערכיו השונים, על קצב התגובה האנזימטית.

ניסוי מקדים

מטרת הניסוי המקדים הינה להחדיר פלסמיד רקומביננטי המכיל Ori, גן המקודד לעמידות לאמפיצלין, גן המקודד ל8 חומצות אמינו היסטדין, אתרי אופרון הלקטוז המהונדס שבו במקום lacZ,lacY,lacA ישנו גן המקודד לPON1, לחיידקי E.coli מזן אוריגמי ולברור בין החיידקים הרקומביננטיים לקופטנטיים.

רשימת כלים, ציוד וחומרים: 2 מבחנות, 3 צלחות פטרי, אמפיצלין, אמבט קרח, חיידקי E.coli מזן אוריגמי, פלסמיד, אגר, אמבט מים בטמפרטורות של 42,37 מעלות צלזיוס, מצע גידול LB, צנטריפוגה קטנה.


מהלך הניסוי המקדים: ראשית, עשינו את שלב הטרנספורמציה- לקחנו שתי מבחנות, באחת מהם היו את החיידקים ,את הפלסמידים ,מצע גידול נוזלי ויוני סידן. בשנייה היו רק חיידקים ומצע גידול נוזלי לשם בקרה. את החיידקים שבמבחנה הראשונה העברנו שוק טרמי על מנת שהפלסמידים יחדרו פנימה והחיידקים יהפכו לרקומביננטיים.
השלב השני הינו ברירה- בשלב זה לקחנו שלוש צלחות פטרי: האחת מכילה מצע גידול של אגר ואמפיצלין ונזרע בו חיידקים שעברו את תהליך הטרנספורמציה- על מנת ללמוד האם הטרנספורמציה בוצעה בהצלחה ורק החיידקים שקיבלו את הפלסמיד נשארו. בשנייה המצע הגידול יהיה אגר ואמפיצלין ונזרע בו חיידקים ללא פלסמידים (בקרה שלילית)- על מנת לאשש את המסקנה שאכן החיידקים שנשארו הם רק חיידקים שקיבלו את הפלסמיד ושאין להם עמידות טבעית לאמפיצלין. בשלישית מצע הגידול יהיה אגר ללא אנטיביוטיקה ונזרע חיידקים שעברו טרנספורמציה (בקרה חיובית)- על מנת לוודא שאין משהו במהלך הניסוי שפוגע בחיידקים.

וריאינט 8C8- וריאנט זה הינו כימרת W.T (דנ"א רקומביננטי של PON1 המורכב מ-4 משפחות של גנים: אדם,ארנבת,עכבר וחולדה) שעברה 3 מוטציות; שונה מהוריאנטים האחרים W.T,H115W, בכך של8C8 יש 3 מוטציות נקודתיות: H115W, L69S,F222S.

תוצאות הניסוי המקדים

Big image
Big image
Big image

דיון בתוצאות ומסקנות הניסוי המקדים

בניסוי המקדים השתמשנו בשלוש צלחות, שתיים בקרה ואחת ניסוי. תפקיד הצלחת הבקרה החיובית (נצפה לקבלת מרבד חיידקים) הינו לברור האם היה גורם שאינו האמפיצלין שפוגע בחיידקים במהלך הטרנספורמציה. כתוצאה מכך שקיבלנו מרבד חיידקים, הסקנו כי לא היה משהו במהלך הניסוי שאינו האמפיצלין שפגע בחיידקים. בנוסף, תפקיד הבקרה השלילית (נצפה לכך שהחיידקים ימותו) הינו לוודא כי אכן לחיידקים אין עמידות טבעית לאמפיצלין. כתוצאה מכך שקיבלנו 0 מושבות חיידקים ניתן להסיק כי באמת אין לחיידקים עמידות טבעית לאמפיצלין. לסיום, תפקיד צלחת הניסוי (נצפה לקבל מספר מושבות חיידקים רקומביננטיים שעברו את הטרנספורמציה בהצלחה) הינו לוודא כי אכן הטרנספורמציה צלחה. כתוצאה מכך שקיבלנו 10 מושבות חיידקים בצלחת הניסוי, ניתן להסיק כי הטרנספורמציה צלחה באופן חלקי וכי קיבלנו חיידקים רקומביננטיים בצלחת הנ"ל.

ניסוי החקר

מהלך הניסוי:
גידול חיידקים עד אמצע שלב לוגריתמי:
בשלב זה גידלנו את החיידקים מזן אוריגמי, שההבדל בינם לבין הזן BL21 הינו שהזן שלנו אינו מפרק קשרי S-S שמשנה את מבנו המרחבי של PON1, שעברו שוק תרמי בתנאי סביבה אופטימלים בתוספת יוני סידן אשר ישמשו לאחר מכן כמבנה של הPON1, למשך שעתיים. לאחר מכן לקחנו דגימות לבדיקת O.D, הכנסנו לספקטרופוטומטר וקיבלנו רמת בליעה של כ0.7O.D - דבר המעיד על כך שהתרבית גדלה עד אמצע השלב הלוגריתמי. בנוסף, טלטלנו את המבחנה בין הפעולות מכיוון שהחיידקים הינם אירובים.

המטרה הינה לקבל כמות מקסימלית של חיידקים אשר עדיין אנרגטיים ושקלטו פלסמיד המכיל את הטרנסגן לPON1 ולעמידות לאמפיצלין.

הפקת כלל חלבוני התא

שלב זה התבצע בשלושה תתי שלבים:
1) השראת ביטוי החלבון - כדי לבטא את הגן הוספנו את החומר IPTG שהוא אנאלוג נפוץ של לקטוז שתפקידו הינו להפעיל את אופרון הלקטוז המהונדס שהחדרנו לפלסמיד הרקומביננטי אשר במקום שיקודד לנו לשלושה חלבוני הLac הוא יקודד לנו לPON1. יתרונותיו על פני הלקטוז הינו שהIPTG אינו מתפרק ולכן אפשר להשתמש בו יותר מפעם אחת וכן, כניסת הIPTG לתא איננה תלויה בפעילות הגן המסייע בהעברת לקטוז דרך הממברנה. בעקבות זאת התחיל התעתוק של הגן. עם סיום ההדגרה סירכזנו את המבחנה מתרבית החיידקים על מנת להיפטר מהמצע גידול.. המטרה של שלב זה הוא לבטא את הגן שנמצא תחת בקרה של אופרון הלקטוז.

2) פיצוץ תאי החיידקים - נעשה באמצעות תמיסה מסחרית שמכילה ליזוזים- שיפרק את דופן תא החיידק, דטרגנט- המפרק את הקרום הפוספוליפידי, נוקלאזות-אנזימים המפרקים DNA וRNA, מעכב פרוטאזות על מנת שלא יפרק את החלבון אך שכן יפרק את דופן תא החיידק. המטרה של שלב זה הוא לשחרר את החלבון מתאי החיידקים.


3) השקעת שברי התאים - העברנו את המבחנות לצנטריפוגה מקוררת וסירכזנו במשך 5 דקות. העברנו את הנוזל העליון שמכיל PON1 וחלבונים אחרים למבחנת פלקון מסומנת. המטרה של שלב זה הינו להישאר ללא השברי תאים.

ניקוי החלבון
על הפלסמיד הרקומביננטי חיברנו גם גן המקודד ל8 היסטידינים אשר יקשרו לPON1, דבר אשר יאפשר בהמשך קישור ספציפי של הPON1 לבידים של ניקל. בעת הברירה, השתמשנו בשני סוגי בופר: שטיפה (נמוך) ומיצוי (גבוה). בכול אחד מהבופרים השתמשנו בריכוז אימידזול שונה. האימידזול המצוי בבופר השטיפה איפשר הרחקה של החלבונים שנקשרו באופן לא ספציפי. העלאת הריכוז בבופר המיצוי גרם לקישור האימידזול לחרוזי הניקל ולהדחת PON1 חזרה לתמיסה. מטרת שלב זה הינה להישאר עם הPON1 ולהפרידו משאר חלבוני התא שנמצאו במבחנת הפלקון.

בדיקת כמות חלבון בשיטת ברדפורד Bradford
איפסנו את קריאת מכשיר הספקטרופוטומטר באמצעות קיווטת בלאנק אשר מכילה בופר אילוציה ו200 מיקרוליטר תמיסת ברדפורד אשר בטבעו הינו בצבע חום ובהוספה של חלבון הוא הופך לכחול. הוספנו 5 מיקרוליטר מהנוזל המכיל את החלבון הרצוי וקראנו את הבליעה בספקטרופוטומטר באורך גל של 595nm.
בדקנו באמצעות עקום כיול ברדפורד את ריכוז החלבון בתמיסה באמצעות שימוש בנוסחה y=0.3264x כאשר רמת הבליעה של הריכוז הרצוי נתון לנו, לכן נציב אותו בערך הy ונמצא את x שהוא ריכוז החלבון הרצוי.
המטרה של בדיקה זו הינה למצוא את הריכוז של החלבון שלנו.

בדיקת פעילות החלבון PON1 (קינטיקה)
העברנו 110 מיקרוליטר מכול מבחנה המכילה תמיסת פאראוקסון בריכוז מתאים אל הבארית המתאימה. לכול בארית הוספנו מתמיסות החלבון PON1 שהפקנו ומדדנו את רמת הבליעה במכשיר האליזה בהפרשי זמן המינימלים האפשריים. מדידה של רמת הבליעה מאפשרת את אפיון רמת הפעילות של האנזים (צבע החלבון הינו צהוב). השתמשנו בPLATE READER באורך גל של 405nm על מנת לקרוא את המספר הרב של הדגימות (התוצר PNPׂ) במהירות. המטרה של שלב זה הינו למדוד את רמת האפיון של הדגימות ובכך להשוות ביניהם.

תוצאות ברדפורד

במהלך ניסוי המחקר שלנו בדקנו את כמות החלבון בשיטת ברדפורד עשינו כך באמצעות הדחת הPON1 מקולונת הניקל. תהליך זה כלל בתחילתו אסיפה של הנוזל הראשון שנזל מהקולונה אשר הכנסנו אותו למבחנה וקראנו לה flow through. לאחר מכן לקחנו חמש מבחנות אפנדורף שקראנו להם wash, ואליהם הדחנו את החלבונים האחרים באמצעות בופר השטיפה. לאחר מכן לקחנו 5 מבחנות אפנדורף שקראנו להם Elution ומספרנו אותם לפי הסדר של הוספת בופר האילוציה ובכך הדחנו את הPON1 מקולונת הניקל. את הספקטרופוטומר איפסנו באמצעות מבחנת הבלאנק שהכילה את ריאגנט ברדפורד ובופר אילוציה ובכך מדדנו את רמות הבליעה של כל אחת ממבחנות הE.

*חישבנו את הריכוז בכל אחת מהמבחנות בכך שהצבנו את רמת הבליעה במשוואה y=0.3264x ומצאנו את הx.
כמות החלבון הסכמית שקיבלנו הינה: 0.9275mg

Big image

ריכוז התוצאות בטבלה

Big image

תוצאות ניסוי הביוטק

תוצאות גולמיות

(לחץ על הכותרת)

Big image
את התוצאות שקיבלנו ממכשיר הPLATE READER עיבדנו בתוכנת האקסל כך שיראה לנו את רמת הבליעה של הPNP באורך גל של 405nm כנגד זמן בריכוזים שונים של חלבון PON1 מוריאנט 8C8 מזן החיידקים אוריגאמי.
Big image
לגרפים שמתוארים לעיל הוצאנו קו מגמה. כידוע לנו, השיפוע של קו המגמה מתאר את קצב התגובה האנזימטית ביחידות של O.D\s. את כלל השיפועים ריכזנו בטבלה כתלות בריכוזים השונים של PON1 ומשם הוצאנו גרף המתאר את השפעת ריכוז החלבון PON1 על קצב התגובה האנזימטית.
Big image

דיון בתוצאות ומסקנות

מהגרפים ניתן לראות ולהסיק כי ככל שריכוז החלבון PON1 ,וריאנט 8C8, מחיידקי Ecoli מזן האוריגמי, גדול יותר, גדל גם קצב התגובה האנזימטית ביחס ליניארי בתחום הריכוזים הנבדק.

בנוסף, אנו מסיקים מהתוצאות שקיבלנו כי ככל שנגדיל את ריכוז האנזים שלנו (PON1) התגובה שתתרחש בינו לבין גז העצבים (האנלוג שלו הינו פאראוקסון) תהיה מהירה יותר מכיוון שככל שריכוז האנזים גבוה יותר הסיכויים שהוא יתנגש בזווית מתאימה ובאנרגיה מספקת עם הסובסטרט שלו הינם גדולים יותר ובכך יווצרו יותר תצמידים משופעלים בעלי אנרגיה גבוהה מספיק על מנת לעבור את מחסום אנרגיית השפעול המתאימה לתגובה ובכך ליצור התנגשות פורייה, כלומר תוצר רצוי (PNP). מכאן נובע כי כנגד יחידת זמן אחת יהיו יותר התנגשויות פוריות בין האנזים לסובסטרט ובכל יחידת זמן אחת יהיה ריכוז גדול יותר של תוצר.

תוצאות קבוצת המחקר והמלצות לחברת התרופות

Big image
Big image
כמו שניתן לראות מהגרף לעיל ומידע קודם, הזן שלנו של חיידקי Ecoli, אוריגאמי, עדיף להפקת PON1 ברמת פעילות מקסימלית מאשר חיידקי Ecoli מזן BL21 ממספר שיקולים שהכרחיים לחברת התרופות.
ראשית, השוני בין זן החיידקים BL21 לבין אוריגאמי הינו כי ישנם שני גנים בBL21 שיוצרים סביבה מחזרת ובכך מפרק את קשרי הS-S שבמולקולת הPON1 ובכך גורמת למבנה המרחבי שלו להיות "פתוח יותר". לעומת זאת בזן האוריגאמי שיתקו את שני הגנים שיוצרים סביבה מחזרת ובכך קשרי הS-S שבמולקולת הPON1 אינם מתפרקים ובכך מבנה הPON1 נשמר בצורתו המרחבית. מן התוצאות ניתן להסיק כי אכן יש חשיבות לשמירת המבנה המרחבי של PON1 על מנת שרמת הפעילות שלו תהיה גבוהה יותר.
היבט היעילות ומידת הפעילות כנגד ההיבט הכלכלי: מן הגרף לעיל ניתן לראות כי הזן שלנו הפיק PON1 שעבור ריכוז X מהירות התגובה הינה גבוהה באופן דרסטי ממהירות התגובה של אותו ריכוז X של PON1 שסונתז ע"י חיידקי Ecoli מזן BL21. מכאן ניתן להסיק כי רמת הפעילות של PON1 שסונתז ע"י זן חיידקי האוריגאמי גבוהה בהרבה מזו של PON1 שסונתז ע"י זן חיידקי BL21 . כידוע, חברת התרופות רוצה שיעילות התרופה שלה תהיה מקסימלית ולכן עליה לבחור בזן חיידקים שמסתנז את הPON1 בעל רמת הפעילות הגבוהה יותר. במקרה זה- האוריגמי. לעומת זאת, הזן שלנו יקר יותר מכיוון שיש צורך בהשתקת שני גנים שהינו תהליך מורכב ויקר. למרות עובדה זו אנו מאמינים כי חברת התרופות צריכה להשתמש בזן האוריגאמי ולא בBL21 מכיוון שההפרש העצום ברמת הפעילות של PON1 שסונתז על ידי כל אחד מהחיידקים השונים עולה, לדעתנו, על ההפרש הכספי.

הצעות לחברת התרופות

אנו מציעים לחברת התרופות לבדוק טווח ריכוזים גדול יותר מאשר הטווח שאנו בדקנו. זאת מפני שבטווח ריכוזים שלנו ריכוז הסובסטרט (פאראוקסון) לא היווה גורם מגביל ולכן לא מצאנו את ריכוז הPON1 המינימלי עבורו קצב התגובה מקסימלי- דבר חיוני מאוד לצורך ההיבט הכלכלי ויעילות התרופה.
בנוסף, אנו מציעים לחברת התרופות לבדוק גם את השפעת סוג הוריאנט על מהירות התגובה האנזימטית על מנת שימצאו גם את הוריאנט שעבורו רמת הפעילות של PON1 היא מקסימלית וההוצאות שלהם יהיו מינימליות.
כמו כן, אנו מציעים לחברת התרופות לעשות חזרות על הניסוי שלנו על מנת להיות בטוחים כי התוצאות שקיבלנו אכן מדוייקות.
לחווית צפייה מקסימלית, אנא הורד את המצגת