פרויקט ביוטק 2016

כיצד סוג מצע הגידול משפיע על רמת הביטוי של PON1 בוריאנט 8C8?

*מצע גידול רגיל (LB) לבין מצע גידול מועשר (2YT)

מבצעי המחקר: יונתן בן ארויה וענבר יעקב

מנחי המחקר: גדי ערמוני, רופאיידה מרווט וירדנה דוד בשיתוף מכון ויצמן

מורה: ענת קפלן

תיכון: "הדרים" הוד השרון

Big image

מבוא למחקר ותיאורו

העולם בו אנו חיים כיום מתפתח בקצב מסחרר. ההתפתחות הטכנולוגית מגיעה לשיאים חדשים מדי יום במגוון תחומי חיים כמו מדע, תקשורת, כלכלה, חברה, רפואה וכדומה. לצד שיפור איכות חיינו וההקלה בניהולם, ההאצה הטכנולוגית מביאה עימה פיתוחים בעלי השפעה רעה אשר מזיקים לחברה בפרט ולמרחב הגלובלי בכלל. פיתוחים אלו כוללים בתוכם פיתוח נשק כימי- ביולוגי (נשק לא קונבנציונלי שמטרתו השמדה המונית). אחד מהסוגים העיקריים והנפוצים של חומרי הלחימה הכימיים הוא גז עצבים. גז עצבים הוא תרכובת אורגנו-זרחתית אשר התגלתה לראשונה בשנת 1937 במהלך מלחמת העולם השניה. תסמיני שאיפת גז העצבים הם תסמונת "האדם הנוזל" (הפרשת נוזלים מהגוף- זיעה, שתן, רוק וכדומה), פירכוסים ועוויתות ולבסוף מוות. גז העצבים גורם לעיכוב פעולת האנזים אצטיל-כולין אסטראז שתפקידו לפרק את הנוירוטרנסמיטר אצטיל-כולין. גז העצבים נקשר אל האנזים אצטיל-כולין אסטראז ולכן האנזים לא מפרק את הקשר בין הקולטנים לבין האצטילכולין, המשך נוכחותו גורם להפעלה מתמדת של התא הפוסט-סינפטי וכתוצאה מכך לא מתקיימת הרפיה של שרירי הגוף שעלולה להוביל אף למוות.

כיום, בשביל שגז העצבים לא ייקשר אל האצטילכולין אסטראז, קיים טיפול שנקרא אטרופין. האטרופין נקשר לקולטנים של האצטיכולין ופעולתו מצטמצמת. טיפול זה גורם לנזק נוריולוגי וחשוב להשתמש בו במינון. בגלל שיש בביצוע טיפול זה חסרונות, אנשים רבים חיפשו דרכים שונות למנוע את השפעות גז העצבים, והפיתרון שמצאו הוא גן ה-PON1. לשימוש ב-PON1 יתרונות רבים על פני השימוש באטרופין מבחינה כלכלית, בריאותית ובנוסף הוא מטפל בשורש הבעיה לעומת אטרופין שרק מצמצם את עוצמת התסמינים.

במסגרת לימודנו במגמת ביוטכנולוגיה, אנו נחשפים לפיתוחים שונים המשתמשים במרכיבים לשיפור איכות חיינו.

אחד מהפיתוחים אליהם נחשפנו הוא פיתוח הגן המקודד ל-PON1. ההיבט שאנו נבדוק באמצעות הניסוי אותו נבצע במכון ויצמן הוא היבט כלכלי. אנו נגדל וריאנט של PON1 שנקרא 8C8 בשני סוגים שונים של מצעי גידול- מצע גידול רגיל (LB) המכיל 8gIL Tryptone (מקור לחומצות אמינו), 5gIL Yeast Extract (תמצית שמרים) ו2.5g נתרן כלורי NaCl, ומצע גידול מועשר (2YT), המכיל את אותם המרכיבים הקיימים במצע הגידול הרגיל, רק בכמות כפולה.

בניסויינו, אנחנו נבדוק היכן הפקת הגן מגיעה לרמת ביטוי יותר גבוהה והאם יש הבדל ברמת הביטוי של PON1 בין מצע הגידול הזול ליקר יותר. כלומר, שאלת המחקר שלנו היא כיצד סוג מצע הגידול משפיע על התרבות החיידקים עם PON1 בוריאנט 8C8?

ניסוי מקדים

1.טרנספורמציה לחיידקי E.coli-

מטרת השיטה: החדרת הפלסמיד הרקומביננטי המכיל: גן המקודד ל-PON1 על בסיס אופרון הלקטוז, 8 היסטידינים הקשורים אל הגן PON1, אמפיצילין ו- Ori אל החיידקים

תיאור השיטה: מכינים 2 מבחנות, האחת כוללת מצע גידול CaCl2, LB, חיידקים ופלסמידים והשנייה כוללת בתוכה את כל המרכיבים פרט לפלסמידים (יוני הסידן מאפשרים קירוב בין פלסמידים וחיידקים שמטענם שלילי). את החיידקים נעביר בשוק תרמי בכדי להחדיר לתוכם את הפלסמיד- תחילה נשים את המבחנות עם החיידקים בקרח, לאחר מכן נעביר אותם לטמפרטורה של 42 מעלות, נחזירם לקרח ולבסוף ניתן להם זמן להתאוששות בטמפרטורה של 37 מעלות.

2.שם השיטה: זריעה וברירה של החיידקים.

מטרת השיטה: לברור ולמפות את החיידקים שקיבלו את הפלסמיד הרצוי מאלו שלא קיבלוהו.

תיאור השיטה: נזרע את תכולת המבחנות בשלוש צלחות פטרי שונות, אחת תכיל אגר, אמפיצילין, ואת תכולת מבחנת הניסוי הניסוי הכוללת חידקים טרנסגנים (בכדי לקבל רק את החידקים אשר קלטו את הפלסמיד). צלחת נוספת שמכילה אגר ואמפיצלין אך בנוסף חידקים ממבחנת הבקרה ( כדי לודא שלחידקים לא קיימת עמידות טבעית לאמפיצילין) וצלחת שלישית שתכיל אגר ואת תכולת מבחנת הבקרה (כדי לבדוק שלא קיים גורם אחר האחראי למוות החידקים מלבד האמפיצילין) - נמשיך עם צלחת מספר 1 בה יש חידקים טרנסגנים.

תוצאות הניסוי המקדים

Big image

דיון בתוצאות הניסוי המקדים

24 שעות לאחר זריעת החיידקים, בדקנו מה קרה בכל צלחת פטרי אליה החדרנו חיידקים משני סוגים שונים- חיידקי E.Coli רגילים ללא פלסמיד, וחיידקים טרנסגנים (בעלי פלסמיד רקומביננטי). התכנון, היה לקבל 3 צלחות פטרי שונות - אחת עם אגר בלבד, (בקרה חיובית), שתי צלחות עם אגר+אמפצילין - אל האחת החדרנו חידקים רקומביננטים (צלחת הניסוי) ואל השני החדרנו חידקים ללא פלסמיד (בקרה שלילית). בשל אי דיוקים קיבלנו צלחת פטרי נוספת שהייתה אמורה להוות את צלחת הניסוי (אך היא הזדהמה).

- בצלחת הניסוי התפתחו 4 מושבות, בצלחת הבקרה החיובית נוצר מרבד חידקים משני הסוגים (טרנסגנים ולא טרנסגנים), בצלחת הבקרה השלילית לא התפתחו חידקים כלל ולכן הסקנו כי לחידקים אין עמידות טבעית לאמפיצילין. ובצלחת הרביעית שלנו, בה התקיים סיכוי לזיהום נוצרו 8 מושבות חידיקים.

מתוצאות אלו, אנו למדים כי החידקים שקיבלנו בצלחת הניסוי, אכן חידקים טרנסגנים כשירים להמשך הניסוי.

1. שם השיטה : גידול החיידקים הטרנסגנים עד אמצע השלב הלוגריתמי

מטרת השיטה :קבלת כמות חיידקים טרנסגנים גדולה שתבטא בהמשך את PON1 בוריאנט 8C8

תיאור השיטה : - לוקחים דגימה של חיידקים רקומביננטים מצלחת הניסוי של הניסוי המקדים.

-מכניסים לארלנמייר המכיל מצע גידול נוזלי (LB)

-למצע הגידול מוסיפים אמפיצילין על מנת שחיידקים הנמצאים בסביבה החיצונית לא יזהמו את מערכת הגידול.

-מוסיפים למצע הגידול גם יוני סידן כדי שישתמשו בהם לייצור PON1

-מטלטלים את בקבוקי הארנלמייר במטרה להגדיל את שטח הפנים לחדירת חמצן.

-לוקחים דגימת חיידקים ובודקים את רמת הבליעה בספקטרופוטומטר באורך גל λ=600nm.

-כאשר רמת הבליעה מגיעה ל-0.6-0.8 מפסיקים את גידולם.

*מבחנת הבלנק מכילה את מצע הגידול בלבד.

2.שם השיטה: הוספת IPTG



מטרת השיטה: השראת ייצור החלבון בחיידקים

תיאור השיטה: נוסיף אל תרבית החיידקים IPTG לאחר סיום התרבותם

ה-IPTG נקשר לרפרסור שעל אופרון הלקטוז המהונדס וכך מאפשר יצירת mRNA המקודד ליצירת PON1. לאופרון הלקטוז יש מספר חלקים- I (הגן המווסת), P (האתר המקדם), O (האתר המפעיל) ועוד שלושה גנים מבניים (Lac A, Lac Y, Lac Z). את אופרון הלקטוז הטבעי אנו מהנדסים בכדי להפיק את הגן המקודד לPON1 בכך שנחליף את הגנים המבניים הקיימים באופרון הלקטוז הטבעי לגן המקודד לPON1.

ישנם שני יתרונות להוספת IPTG במקום לקטוז:

כאשר מוסיפים לקטוז למערכת, החיידקים מפרקים אותו וגורמים לכך שכמותו הולכת וקטנה. לעומת זאת, ה-IPTG אינו מפורק על ידי החיידקים וקצב ביטוי הגנים נותר קבוע. יתרון נוסף הוא שחדירתו אל התא היא ללא נשא בעזרת דיפוזיה בניגוד אל הלקטוז שדורש נשא כדי לחדור את קרום התא.

3.שם השיטה: סרכוז בצנטריפוגה

מטרת השיטה: הפרדת מצע הגידול מהחיידקים בעלי הגן PON1.

תיאור השיטה: צנטריפוגה היא מכשיר להפרדת חומרים על פי צפיפותם. ככל שחומר הוא בעל צפיפות גדולה יותר הוא שוקע לתחתית המבחנה. לכן, כאשר אנו שמים את מצע הגידול עם החיידקים בתוך הצנטריפוגה, החיידקים, שהם בעלי צפיפות גדולה יותר מאשר מצע הגידול הרגיל בהם הם שרויים, יהיו בחלק התחתון של המכשיר (המשקע) ואילו מצע הגידול יהיה הנוזל בחלק העליון (הליזט) של המכשיר. בכך, נוכל להשתמש רק במקטע התחתון שמכיל את משקע החיידקים.

4.שם השיטה: פיצוץ תאי החיידקים

מטרת השיטה: הוצאת החלבון מתאי החיידקים.

תיאור השיטה: פיצוץ תאי החיידקים נעשה באמצעות תמיסה הנקראת BugBuster. תמיסה זו מכילה ארבעה תפקידים: ליזוזים- מפרק את דופן תא החיידק ומגביר את ייעילות הפירוק. דטרגנט- מפרק את הקרום הפוספוליפידי. נוקלאזות- מפרק DNA ו-RNA וכך מאפשר קבלה של תמיסה צלולה. מוסיפים גם מעכב פוטאזות אשר מפרק אנזימים אשר מפרקים חלבון מסוג פרוטאזות. אנזימים אלה קיימים באופן טבעי בתא החידק ובעת הפיצוץ עלולים לפרק את החלבון PON1.

5. שם השיטה: השקעת שברי התאים וסרכוז נוסף בצנטריפוגה

מטרת השיטה: אסיפת החלבונים שהיו בתוך תאי החידקים.

תיאור השיטה: על מנת להפריד בין שברי הקרומים לבין החלבונים שבחיידקים נסנתז את תאי החיידקים בצנטריפוגה בשנית. לכן, לאחר הסרכוז הנוסף המקטע התחתון יכיל את שברי הקרומים של החידקים, והמקטע העליון (הליזט) יכיל את החלבונים. בסרכוז זה ממשיכים עם הנוזל העליון (החלבונים), מכיוון שהוא מכיל את הגן שאנו מנסים להפיק- PON1.

6. שם השיטה: ניקוי החלבון בעזרת קולונת זיקה מסוג קולונת ניקל.

מטרת השיטה: להפריד בין החלבון PON1 לבין החלבונים האחרים שסונתזו בחיידקים שנמצאו בליזט גם הם.

תיאור השיטה: נאחה את הגן לPON1 עם מקטע DNA הכולל רצף של שמונה היסטידינים. מקטע זה נצמד אל הPON1 ומאפשר קישור שלו אל בידים (חרוזים) של ניקל מפני שחלק ממבנה ההיסטידינים הוא טבעת אמיזדולית, וליוני הניקל (Ni+2) זיקה חזקה לטבעת האמידזולית. כך, לחלבון PON1 יש יתרון על חלבונים אחרים בהיקשרותו אל הבידים של הניקל.

בשיטה זו נשתמש בשני בופרים:

-בופר שטיפה (washing buffer) - בבופר זה ריכוז נמוך של אימידוזול (20mM) בופר זה משמש לכך שהחלבונים האחרים ישטפו החוצה ורק PON1 יקשר לחרוזי הניקל

- בופר מיצוי (elution buffer) - בבופר זה ריכוז נמוך של אימידוזול (500mM). בופר זה משמש להדחת PON1 מהיקשרותו עם חרוזי הניקל החוצה אל המבחנה.

7.שם השיטה : בדיקת ריכוז החלבון בשיטה ספקטרופוטומטרית עם ריגאנט ברדפורד.

מטרת השיטה : בדיקת כמות החלבון שהתקבל לאחר ניקוי החלבון בקולונת ניקל.

תיאור השיטה : נוסיף אל החלבון את ריאגנט ברדפורד. בהיותו סמוך לחלבון PON1 הוא משנה את צבעו מצהוב-חום לכחול, רמת הבליעה נמדדת באורך גל של 595nm=λ. נקבע את ריכוזו של החלבון באמצעות הצבה במשואת הקו הישר של עקומת הכיול. מבחנת הבלנק תכיל ברדפורד ובופר אילוציה.

Big image

8. שם השיטה: הרצת חלבונים באלקטרופורזה בג'ל (SDS page)

מטרת השיטה: בדיקת רמת הביטוי של PON1.

תיאור השיטה: את החלבונים נכניס לתערובת המכילה SDS ששוברת את קשרי המימן ומטענה שלילי (כך נוכל להבטיח שהחלבון ירוץ לאנודה) ומרקפתואתנול ששובר קשרי S-S שהם מהווים את המבנה השניוני והשלישוני של PON1. כך נשבר המבנה המרחבי של החלבונים ונוצר מבנה לינארי, זאת בשביל שרק גודלו ישפיע על מרחק הריצה בג'ל ולא מבנהו המרחבי. נדע מיהו PON1 על כך שנשווה את גודלו לסמן הגודל 40KD. ככל שהפס עבה יותר וכהה יותר זה סימן שנוצר יותר PON1.

Big image

תוצאות

מציאת ריכוז החלבון עם ריאגנט ברדפורד

בכדי להגיע למטרה המכוונת של הניסוי, שהיא יצירת כמות PON1 מירבית, השתמשנו בקולונה מסוג קולונת ניקל בכדי לבודד את חלבון הPON1 משאר החלבונים. תחילה השתמשנו בבופר שטיפה 5 פעמים, ולאחר מכן השתמשנו בבופר הדחה 5 פעמים, וקיבלנו 5 מבחנות בעלות נפח שווה עם ריכוזים שונים של חלבון PON1.

לאחר בידוד ה-PON1, השתמשנו בשיטה מיוחדת למציאת ריכוז החלבון והיא על ידי בדיקת רמת בליעה של ריאגנט ברדפורד בנוכחות חלבון. לכל אחת מהמבחנות הוספנו 795Mm מים, PON1 5Mm ו- 200Mm ריאגנט ברדפורד, ולאחר מספר שניות ראינו שהתמיסה החומה ההתחלתית החלה לשנות את צבעה לכחול. השינוי בכל מבחנה היה שונה מכיוון שריכוזי ה-PON1 היו שונים- ככל שהריכוז היה יותר גבוה, השינוי היה יותר דומיננטי והצבע הכחול נהיה יותר בולט.

לאחר מכן, הכנסנו את כל המבחנות לספקטרופוטומטר כדי לבדוק את רמת הבליעה של התמיסות. בכך, רצינו למצוא את המבחנה שבה רמת הבליעה היא הגבוהה ביותר, שבה ריכוז ה-PON1 הכי גבוה.

טבלת תוצאות ריכוזי החלבון

כמות חלבון כוללת: 1.15 מיליגרם

ההרצה בSDS-PAGE

לאחר בדיקת כמות החלבון אשר התקבל מהניסוי (בשיטת ברדפורד), עלינו לבדוק את כמות הPON1 מתוך כלל החלבון. לשם כך, לקחנו את המבחנה ממנה קיבלנו את כמות החלבון המירבית ביותר- מבחנה מספר E2. את מבחנה מספר 2 מהלנו בשלושה מיהולים שונים - 1:1 1:4 1:20 עם בופר שטיפה. אל התמיסות הוספנו 15 מיקרוליטר תמיסה המכילה קומסי כחול, SDS PAGE וDTT (שבר את קשרי הS-S). למבחנות האפנדורף הכוללות את 2 התמיסות (תכולת מבחנה E2 במיהולים השונים ובנוסף התמיסה שהוספנו) ביצענו ספין-דאון. מכל מבחנה לקחנו 40 מיקרוליטר והרתחנו ל5 דקות. לאחר ההרתחה העברנו את התמיסות להרצה באלקטרופורזה בג'ל. במכשיר ההרצה שלנו היו 10 באריות וכל אחת מהתמיסות שלנו הוכנסה לבארית אחרת - בבארית הראשונה הכנסנו את התמיסה שריכוזה היה 1:1. לבארית השניה הכנסנו את הריכוז 1:4 ולשלישית את התמיסה עם הריכוז 1:20. אל שלושת הבאריות הבאות בתור הכניסו צוות המחקר שלנו את התמיסות שהתקבלו בניסוי שלהם לאחר המיהולים ואל הבארית השמינית החדרנו סמני גודל.
Big image

דיון בתוצאות SDS PAGE

לאחר ההרצה בSDS PAGE, בחנו את תוצאות הג'ל שלנו שהוא ג'ל מספר 2. כפי שניתן לראות, הבארית הראשונה והרביעית הן בעלות צבע חזק יותר מהבאריות האחרות וזאת מפני שאליהן הוכנסו התמיסות המהולות יותר. שלושת הבאריות הראשונות, כפי שצוין קודם לכן, מכילות בתוכן את התמיסות מהניסוי שלנו, ושלושת הבאריות העוקבות מכילות את התמיסות המהולות של הצוות השני בקבוצת המחקר שלנו. אם נשווה כל בארית שלנו עם הבארית המתאימה של הצוות השני, נוכל להבחין ולהסיק האם קיים איזשהו הבדל או שוני בתוצאות וכך נוכל לענות על שאלת המחקר שלנו ולהסיק את המסקנות המיטביות ביותר.

לאחר השוואה בין הבאריות, ראינו כי לא קיים הבדל מהותי בין תוצאות ההרצה שלנו לבין תוצאות ההרצה של צוות המחקר שלנו. פסי ההרצה היו דומים בדומיננטיות שלהן- אם זה מהול יותר, הפס חלש ואם זה פחות מהול, הפס בולט וחזק.

לכן, בגלל חוסר ההשפעה של מצע הגידול המועשר על תוצאות ההרצה, אנו סבורים כי עדיף להשתמש במצע גידול רגיל מכיוון שלא קיים שום יתרון בשימוש במצע הגידול המועשר, להפך - קיים חיסרון בהיבט הכלכלי מכיוון שמחירו גבוה יותר, והוא לא מספק שום ממצא חדש ששונה מהממצאים בשימוש מצע הגידול הרגיל.

הצעות לשיפור וכיווני המשך

לאחר שסיימנו לבצע את הניסוי, חשבנו על מספר דרכים לייעולו ולשיפורו, במטרה להגיע לתוצאות יותר מדויקות או לתוצאות חדשות שלא התגלו בדרך בה ביצעו את הניסוי עד כה. הסתכלנו על אופן הביצוע של הניסוי וחשבנו מה יכולנו לשנות או לשפר בדרך בה ביצענו אותו.

ראשית, בכדי לקבל את התוצאות המדויקות ביותר הבנו כי רצוי לבצע את הניסוי בסביבה סטרילית יותר- שימוש בכלים פעם אחת בלבד בכדי שלא נשפיע על התוצאות, להימנע ממגע עם החומרים המשתתפים בניסוי וכדומה- כך נוכל להגיע לרמת דיוק גבוהה יותר ולקבל תוצאות מהימנות יותר.

שנית, במהלך הניסוי מדדנו את התוצאות ואת התהליכים שהתרחשו בזמנים הקבועים מראש (לדוגמה, ההרצה באלקטרופורזה בג'ל שהייתה אמורה להיארך 60 דקות) ואילו בניסוי לא דייקנו בזמנים ולעתים תהליכים התרחשו מעבר לזמן הקצוב, ויכול להיות כי דבר זה השפיע על התוצאות שהתקבלו בסופו של הניסוי. לכן, אנו מאמינים כי דיוק בזמנים וניקיון הסביבה בה נערכת הניסוי הינם גורמים חשובים לאיכותם של הניסוי ותוצאותיו.


הניסוי אותו ביצענו עקב אחרי השאלה האם מצע הגידול בו אנו זורעים ובוררים את החיידקים ההתחלתיים משפיע על תוצאות הניסוי. ההרכב של מצעי הגידול הם LB ו2YT. לאחר שראינו את התוצאות גילינו כי אין הבדל משמעותי בין שני מצעי הגידול שאותם בחנו, ולכן עלו לנו שאלות שייתכן ויוכלו להביל לממצאים חדשים ולתשובות שעוד לא קיבלנו.

בגלל ששאלתנו עוסקת במצעי גידול, חשבנו מה היה קורה אם מצע הגידול הנבדק לא היה מכיל את הרכיבים בכמות גדולה יותר אלא רכיבים שונים. האם זה היה הורג את החיידקים, לא משפיע כלל או נותן להם תכונות חדשות שאולי יביאו לתוצאות שונות, לאו דווקא בנושא כמות ה-PON1.

בנוסף, תהינו מה היה קורה אם הרכב הפלסמיד אותו החדרנו אל החיידקים היה שונה. כלומר, אם כמות ההיסטידינים המחוברים אל אופרון הלקטוז המהונדס היה שונה, האם הדבר היה משפיע על התוצאות שקיבלנו או שלא היה מתרחש שום שינוי.

התייחסות לקבוצת המחקר

קבוצת המחקר שלנו הסתובבה בניסוי זה סביב השאלה האם מצע הגידול הוא גורם משפיע בקבלת התוצאות הסופיות שהן למעשה כמות ה-PON1 הסופית. מצעי הגידול שבחנו היו LB, שהוא מצע הגידול הרגיל בו משתמשים במרבית הניסויים, הוא זול יותר ובעל התנאים הרגילים הניתנים לחיידקים אותם רשמנו במבוא המחקר, ומצע הגידול השני היה 2YT, שהוא היווה מצע הגידול המועשר, היקר יותר שאפשר תנאים יותר מיטבים (המרכיבים שהרכיבו את מצע הגידול LB בכמות הגדולה פי 2 מהכמות הרגילה).

בתום הניסוי קיבלנו תוצאות משתי שיטות שונות- האחת, מציאת ריכוז החלבון בעזרת שימוש עם הריאגנט ברדפורד והשנייה, בדיקת רמת ביטוי החלבון על ידי הרצתו באלקטרופורזה בג'ל.

בשיטה הראשונה, רמת הבליעה הגבוהה ביותר אצלנו הייתה במבחנה E2 ולאחר חישובים מצאנו כי כמות החלבון שהתקבל במבחנה זו היה 0.53mg. לאחר השוואה עם צוות המחקר השני בקבוצת המחקר שלנו (מרב לוי ורותם רחמילביץ') מצאנו כי רמת הבליעה הגבוהה ביותר אצלן הייתה במבחנה מספר E1, וכמות החלבון שהתקבל במבחנה זו היא 0.325mg. כמות החלבון שהתקבלה אצל צוות המחקר שלנו הייתה קטנה יותר מהכמות שאנו קיבלנו, בהפרש של כ- 0.2mg.

בשיטה השנייה, לאחר התבוננות במשטח ההרצה הסופי (לאחר שעה של הרצה), ראינו כי פסי ההרצה שלנו ושל צוות המחקר השני בכל אחת מהבאריות היה דומה בהתאמה- כלומר, כאשר המיהול היה 1:1 אצלנו ו-1:1 אצלן, התוצאה של פסי ההרצה היו זהים. לכן יכולנו להסיק כי אין השפעה לסוג מצעי הגידול בהם זורעים את חיידקי הניסוי, מכיוון שהם הביאו אותנו אל אותן תוצאות.

שאלה נוספת שחקרנו בניסוי היא איזה וריאנט יותר טוב- 8C8 או WT?

בכדי לענות על שאלה זו, השוונו את התוצאות שלנו עם צוות המחקר שבדק מה תוצאות הניסוי בשימוש במצע גידול זהה לשלנו, אך עם וריאנט WT. (אביב מאיר ועומר ארליך) כמות החלבון המירבית שהם קיבלו הייתה במבחנה E2 והיא 1.25 מיליגרם. כמות החלבון שהם קיבלו הינה גבוהה משלנו, לכן על פי שיטת מציאת כמות החלבון עם ריאגנט ברדפורד, עדיף השימוש בוריאנט WT על פני 8C8.

בהרצת החלבון באלקטרופורזה בג'ל, ראינו כי פסי ההרצה שהתקבלו עם הוריאנט שלהם היו עבים וכהים יותר, מה שמראה על דומיננטיות גבוהה יותר של החלבון וכתוצאה מכך יכולנו להסיק את התשובה לשאלתנו- ביצוע הניסוי עם וריאנט W.T עדיף על פני ביצוע עם וריאנט 8C8.

Big image

נספחים