פרוייקט ביוטק 2016

מגישות: מאי אנזל, קרן לונדנר והדס נגבי

כיתה: יא'2

תיכון: הדרים, הוד השרון

שמות המנחים: גדי ערמוני, ירדנה דוד

שם המורה: ענת קפלן

בחסות מכון ויצמן למדע

כיצד משפיע זמן הדגרת החיידקים במשרן IPTG על ביטוי הגן המקודד לPON1 בוריאנט 8C8?

מבוא

גז עצבים הינו תרכובת אורגנוזרחתית חסר ריח , טעם וצבע כאשר נמצא בטמפרטורת החדר. גז העצבים הינו חומר רעיל ומסוכן לאדם ולחיות. גזי העצבים פוגעים במערכות גוף רבות, אך המשותף לכולם הוא הפגיעה בהולכה העצבית בין תאי העצב עצמם ובין תאי עצב לתאי הגוף, כך שתפקודם נפגע. בין היתר גז עצבים גורם לפרכוסים ועוויתות בשל התכווצות שרירים, וכן לתסמונת האדם הנוזל - הפרשה של רוק, נזלת, דמעות, זיעה, הקאות וכו' תסמונת זו יכולה לגרום למות בשל הפסקת פעולת שרירי הנשימה. בנוסף, גז העצבים גורם לחוסר פעילותו של אצטילכולין אסטראז, ולכן הנוירוטרנסמיטר אצטילכולין נשאר קשור לקולטנים שעל גבי התא הפוסט סינפטי (תא עצב, תא בלוטה, תא שריר) וגורם לתא הפוסט סינפטי להמשיך את פעולתו ללא קשר לגירוי.

הטיפול שקיים כיום כנגד גז עצבים הוא אטרופין, שמתחרה עם אציטלכולין על היקשרותו לקולטנים שעל גבי התא הפוסט סינפטי דבר שמפחית את סיכויו של הנוירוטרנסמיטר אצטילכולין להקשר לקולטנים שעל גבי התא הפוסט סינפטי ולכן פעילותו של האציטלכולין מצטמצמת ותאי הגוף מופעלים בעוצמתיות נמוכה יותר. קיים חיסרון בשימוש באטרופין כיוון שהוא גורם לנזק נוירולוגי ובמינון גבוהה יכול לגרום אף לאיבוד הכרה. בניגוד לאטרופין החלבון PON1 אשר מפרק תרכובות אורגנוזרחתיות כגון גז עצבים נמצא מתאים יותר בשל יתרונותיו על פני אטרופין: הוא אינו גורם לנזק נוירולוגי מסויים, מהווה יתרון כלכלי - אנזים אינו משתנה במהלך תגובה אנזימתית ויכול לפעול פעמים רבות ולכן ידרשו מינונים נמוכים להזרקה, כך יצטרכו להשקיע פחות כסף. בנוסף, חלבון זה יכול להיקשר לגז העצבים עצמו מכיוון שעל גביו ישנו אתר הפעיל אליו גז העצבים יכול להיקשר וע"י כך האנזים יכול לפרקו לגמרי. כלומר, האנזים מטפל בשורש הבעיה לעומת אטרופין שמצמצם את עוצמתם של התסמינים בעקבות חשיפה לגז עצבים. PON1 מיוצר באופן טבעי בגוף ולכן מערכת החיסון לא תדחה אותו לעומת אטרופין שמיוצר באופן כימי במעבדה.

לנוכח היתרונות הרבים שיש ל - PON1 אנו רוצות לתרום למחקר ולייעל את המחקר תוך מציאת הזמן האופטימלי להדגרת החיידקים המכילים את הגן PON1 בוריאנט 8C8 במשרן IPTG.

שאלת החקר

כיצד משפיע זמן הדגרת החיידקים במשרן IPTG על ביטוי הגן המקודד לPON1 בוריאנט 8C8?


הוריאנט 8C8 הוא כימרה של PON1 המורכבת מארבע משפחות של גנים: אדם, ארנבת, עכבר וחולדה.

לוריאנט זה ישנן שלוש מוטציות נקודיות:

1. H115W - במקום ה- 115 חומצה אמינית היסטידין הוחלפה בחומצה אמינית טריפטופן.

2. L69S - במקום ה- 69 חומצה אמינית לאוצין הוחלפה בחומצה אמינית סרין.

3. F222S - במקום ה- 222 חומצה אמינית פנילאולין הוחלפה בחומצה אמינית סרין.

השערה

ככל שנשרה את החיידקים הרקומביננטים זמן רב יותר במשרן IPTG כך רמת ביטוי הגן המקודד ל- PON1 בוריאנט 8C8 תהיה גדולה יותר עד לזמן אופטימלי.


הסבר ההשערה

ככל שנשרה את החיידקים הרקומביננטים זמן רב יותר במשרן IPTG, כך הסיכוי של ה-IPTG להיקשר לרפרסור יהיה גדול יותר. דבר זה יביא לכך שהסיכוי של מולקולות הרפרסור להיקשר לאתר המפעיל יקטן וכך מבחינה מרחבית תתאפשר היקשרותו של הרנ"א פולימראז לאתר המקדם. הרנ"א פולימראז יאפשר את היווצרותו של mRNA וכן תיעתוק החלבונים המבוקשים ללא גורם שיפריע, כך רמת ביטוי החלבונים תהיה גדולה יותר. זמן ההדגרה בסופו של דבר לא ישפיע על רמת הביטוי של PON1 מסיס ויעיל ויהווה גורם מגביל מכיוון שכאשר כמות ה-PON1 גדולה מאוד, החיידקים נוטים לסגור אותו בגופיפי הסגר. במצב זה PON1 הופך לצבר אשר אינו מסיס ואינו יכול לפעול ולפרק גז עצבים וכך רמת הביטוי של PON1 יעיל לפירוק גז עצבים תישאר קבועה.

המשתנים: משתנה תלוי- רמת ביטוי הגן המקודד ל-PON1 בוריאנט 8C8. נמדוד את ריכוז החלבון המבוקש שהתקבל באמצעות שיטת ברדפורד המודדת את רמת הבליעה של ריכוז החלבון שהתקבל בעזרת ריאגנט ברדפורד באמצעות ספקטרופוטומטר, וכן נבדוק את רמת ביטויו באמצעות הרצה באלקטרופורזה בג'ל (ככל שהפס שיתקבל עבה וכהה יותר, כך רמת הביטוי גבוהה יותר).

משתנה בלתי תלוי- זמן הדגרת החיידקים הרקומביננטים במשרן IPTG. נשרה את החיידקים הרקומביננטים בזמנים שונים שנמדוד באמצעות סטופר (חצי שעה, שעה, שעה וחצי, שעתיים, שעתיים וחצי, שלוש שעות).


הגורמים הקבועים בניסוי: סוג הווריאנט אותו בודקים (8C8), משרן IPTG, ריכוז המשרן, מצע הגידול LB, חיידקי הניסוי (E.coli) המכילים אותו פלסמיד רקומביננטי וטמפרטורה.


סוג הבקרה: בקרה פנימית השוואתית

חזרות: לא נעשו חזרות בניסוי.

יש חשיבות לביצוע חזרות על מנת לשפר את דיוק התוצאות ומהימנותן.

ניסוי מקדים

טרנספורמציה

מטרת השיטה: הכנת חיידקים המכילים את הגן המקודד ל- PON1 בשיטות של הנדסה גנטית.

תיאור השיטה: נכין שתי מבחנות:

מבחנת אחת - מבחנת ניסוי שתכיל מצע גידול נוזלי LB, חיידקים, פלסמידים ויוני סידן.

מבחנה שניה- מחנת בקרה שתכיל מצע גידול נוזלי LB, חיידקים ויוני סידן.

הוספנו יוני סידן על מנת לגשר בין הפלסמיד לבין תא החיידק. גם הפלסמיד הוא בעל מטען חשמלי שלילי בגלל קבוצת הזרחה שעל גבי הדנ"א, וגם קרום התא הוא בעל מטען שלילי ולכן יוני הסידן שהם בעלי מטען חיובי יגשרו בין השתיים.

בנוסף , נפעיל שוק תרמי שמבוסס על הפרשי טמפרטורות נדגיר את החיידקים תחילה בקרח, לאחר מכן נדגיר אותם בטמפרטורה של 42 מעלות ההפרש בין טמפרטורה נמוכה לגבוהה יגדיל את הנקבים בקרום התא, אח"כ שוב בקרח כדי לסגור את הנקבים ולבסוף ניתן להם טמפרטורה של 37 מעלות, זוהי הטמפרטורה האידיאלית לפעילותם כדי שהחיידקים ירגעו ויתחלקו.

הפלסמיד הרקומביננטי מכיל:

גן לעמידות לאמצפיצילן - על מנת שנוכל לברור בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד לאלו שלא.

גן המקודד ל-PON1 בוריאנט 8C8 - על מנת שהחיידקים יוכלו לסנתז עבורנו את PON1 המבוקש בהמשך הניסוי.

אופרון הלקטוז המהונדס - המכיל במקום גנים מבניים את הגן המקודד לPON1 בוריאנט 8C8 וזאת על מנת שהחיידקים יסנתזו את PON1 תחת בקרת אופרון הלקטוז, כדי שהחיידקים לא יבזבזו לשווא אנרגיה.

Ori - מקטע דנ"א המשכפל את הפלסמיד בתוך תא ללא קשר לשכפול החיידקים.

שמונה חומצות היסטידין- (זנב אימידוזולי) - זאת על מנת להעניק לחלבון - PON1 יתרון בשלב ניקוי החלבון - PON1 משאר החלבונים שהחיידקים יצרו בעזרת קולנת ניקל.

שלב הזריעה והברירה

מטרת השיטה: לברור בין בחיידקים שקלטו את הפלסמידים הרקומביננטים לאלו שלא.

תיאור השיטה: בשלב זה נשתמש בשלוש צלחות פטרי:

1. תכיל אגר+אמפיצילין- עליה נזרע חיידקים ממבחנת הניסוי. המטרה בצלחת זו היא לברור בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד לבין אלו שלא מכיוון שעל גבי הפלסמיד קיים גן נוסף המקנה עמידות לאמפיצלין.

2. תכיל אגר+אמפיצילין- עליה נזרע חיידקים ממבחנת הבקרה. מטרת צלחת זו היא לבדוק שאין לחיידקים עמידות טבעית לאמפיצילין.

3. תכיל אגר+ חיידקים ממבחנת הניסוי. המטרה בצלחת זו היא לבדוק שאין שום גורם אחר במהלך הניסוי שגרם למותם, אלא רק האמפיצלין.

Big image

תוצאות

Big image
Big image

דיון בתוצאות

לאור התוצאות שהתקבלו מהניסוי המקדים ניתן לראות כי דרך הברירה הייתה מתאימה ורק האמפיצלין הוא זה שגרם למותם של החיידקים שלא קלטו את הפלסמיד מכיוון שבצלחת הניסוי קיבלנו מספר בודד של מושבות של חיידקים.

בנוסף, ניתן להבין כי במהלך הניסוי לא היה גורם שונה מהאמפיצילין אשר גרם למותם של החיידקים כיוון שבצלחת בה היו אגר+חיידקים ממבחנת הניסוי (צלחת הבקרה החיובית) התקבל מרבד חיידקים.

כמו כן, הצלחת שהכילה אגר+אמפיצלין וחיידקים ממבחנת הבקרה (צלחת הבקרה השלילית) ניתן להבין כי לחיידקים אין מטבעם עמידות לאמפיצלין כיוון שבצלחת זו לא התקבלו כלל מושבות חיידקים.

לאחר, הניסוי המקדים המשכנו עם החיידקים ממבחנת הניסוי.

ניסוי חקר

גידול החיידקים הטרנסגנים עד לאמצע השלב הלוגרתמי

מטרת השיטה: לקבל כמות גדולה של חיידקים טרנסגנים שיבטאו ויסנתזו בהמשך את האנזים PON1.

תיאור השיטה: מגדלים את החיידקים שנלקחו בניסוי המקדים (צלחת הניסוי) במצע גידול נוזלי, LB.

מוסיפים למצע הגידול:

אמפיצילין - כדי שמערכת הניסוי לא תזדהם בחיידקים מהסביבה החיצונית.

יוני סידן - על מנת שהחיידקים יכלו לסנתז את PON1 באתר הפעיל,

את החיידקים מטלטלים, על מנת להגביר את החדרת החמצן, למנוע את שקיעתם של חיידקים ולגרום לערבוב אחיד. כדי לדעת שהחיידקים הגיעו לאמצע השלב הלוגרתמי נבדוק בספקטרופוטומטר את רמת הבליעה באורך גל של 600nm. כאשר מגיעים ל0.6-0.8OD נעצור את גידולם. מבחנת הבלנק מכילה את מצע הגידול בלבד.

הדגרת החיידקים הרקומביננטים במשרן IPTG

מטרת השיטה: החיידקים יבטאו את הגן שמקודד ל - PON1 תחת בקרת אופרון לקטוז.

תיאור השיטה: בשלב זה משרים את החיידקים הרקומביננטים במשרן IPTG שהוא אנלוג ללקטוז. ה - IPTG נקשר אל הרפרסור ומנטרל אותו ואז הרנ"א פולימראז יוכל להיקשר לאתר המקדם (P) וליצור mRNA המקודד לאנזים PON1.

למרות שבבסיסו אופרון הלקטוז פועל עם סוכר לקטוז לשימוש בIPTG יש יתרונות על פני הלקטוז : IPTG אינו מפורק על ידי החיידק ולכן רמתו נשארת קבועה וכך לא צריך להוסיף עוד ריכוזים של IPTG על מנת שאופרון הלקטוז יסנתז את הmRNA פולימראז המקודד לאנזים PON1 בנוסף כניסתו לתא החיידק אינה תלויה בנשא.

בניסוי שלנו אנחנו מדגירים את החיידקים ב- IPTG בזמנים שונים בטווח של שלוש שעות כל חצי שעה.

סירכוז בצנטריפוגה

מטרת השיטה: להפריד בין מצע הגידול לחיידקים הטרנסגנים.

תיאור השיטה: עם סיום ההדגרה בIPTG מעבירים את המבחנות לצנטריפוגה (מכשיר שמפריד חומרים ע"פ צפיפותם) למשך חמש דקות עד להווצרות משקע.

פיצוץ תאי החיידקים

מטרת השיטה: לשחרר את ה- PON1 מתאי החיידקים.

תיאור השיטה: פיצוץ החיידקים הוא פיצוץ כימי הנעשה באמצעות BUGBUSTER. תמיסה זו תפקידה לפרק את דופן תא החיידקים והיא מכילה :

ליזוזום - אנזים שמפרק את דופן תא החיידק.

דטרגנט - מפרק את המרכיבים הפוספולפידים (שומני) של קרום התא.

נוקליאזות - אנזים שמפרק דנ"א, רנ"א על מנת לקבל תמיסה צלולה.

PIC - בתא החיידק קיימים אנזים שמפרקים חלבונים על מנת שאנזים אלו לא יהרסו את PON1 נוסיף מעכבים לאנזים אלו.

סירכוז נוסף בצנטריפוגה

מטרת השיטה: להפריד בין שברי הקרומים לבין החלבונים שהחיידקים סנתזנו.

תיאור השיטה: לאחר פיצוץ התאים מעבירים את המבחנות לצנטריפוגה למשך חמש דקות כדי להפריד את שברים מהחלבון PON1 שנמצא בשכבת הליזט (נוזל שמכיל את החלבונים שהחיידקים סינתזו).

ניקוי החלבון בעזרת קולונת ניקל (קולונת זיקה)

מטרת השיטה: להפריד בין החלבון PON1 לבין שאר החלבונים שסנתזו החיידקים ומצויים כולם בליזט באמצעות קולנת ניקל ובופר שטיפה.

תיאור השיטה: ההפרדה של PON1 משאר החלבונים נעשית באמצעות קולונת זיקה מסוג קולונת ניקל. ליוני הניקל יש זיקה לטבעת אימידוזולית , לכן נקנה יתרון ל - PON1 על ידי חיבור של מקטע דנ"א קצר שמאוחה לגן המקודד ל- PON1. כאשר מקטע דנ"א זה יתבטא, יווצר ל - PON1 זנב של שמונה חומצות היסטידין . בשלב הראשון נשים את חרוזי הניקל והחלבונים בסירכוז למשך שעה על מנת שה- PON1 יקשר אליהם ונוכל לשטוף את שאר החלבונים מהקולונה ללא בופר שטיפה (F.T). את הנוזל שנשטף נשפוך למבחנת אפנדרוף עם בופר שטיפה, בופר השטיפה תפקידו לשמור על pH קבוע אופטימלי לPON1 והוא מכיל ריכוז נמוך של אימידוזול. בשלב זה, ה - PON1 יקשר לחרוזי הניקל ושאר החלבונים שנשארו במבחנה ישטפו החוצה. על תהליך זה נחזור שלוש פעמים בשלוש מבחנות wash שונות (w1,w2,w3) על מנת לוודא שכל החלבונים הלא רצויים ישטפו. בשלב השני, נשתמש בבופר ההדחה (אלוציה) שריכוז האימידוזול בו גבוה, מטרתו של שלב זה, להדיח את PON1 שקשור לחרוזי הניקל. נשאר עם מבחנה (E1) שמכילה ברובה את-PON1 ואיתה נמשיך לבדיקה של שאלת החקר .

בדיקת ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד וקריאה באמצעות ספקטורופטומטר באורך גל 595 ננומטר

מטרת השיטה: לחשב את ריכוז החלבון PON1 במבחנת הניסוי באמצעות ספקטרופוטומטר בשיטת ברדפורד ע"י ריאגנט ברדפורד.

תיאור השיטה: בשלב זה נחשב את ריכוז החלבון במבחנה. נמדוד בספקטרופטומטר (מכשיר למדידת בליעת אור באופן מדוייק) את רמת הבליעה של מבחנת הבלנק ( מבחנה זו מכילה בופר אילוציה ותמיסת ברדפורד) כדי לאפס את הספקטרופטומטר על מנת שלא יחשיב את רמת הבליעה של בופר האילוציה ותמיסת הברדפורד. לאחר איפוס הספקטרופטומטר נעביר את החלבון במבחנת הניסוי לקיווטה (מבחנה מיוחדת שלא בולעת אור), נקרא את רמת הבליעה של התמיסה בקיווטה בספקטרופטומטר ונקבע את ריכוז החלבון על פי קו המגמה ומהוצאת משוואת הקו הישר מתוך עקומת כיול ברדפורד שהוכנה מראש על ידי מכון ויצמן.

יתרונות השימוש בשיטת ברדפורד על פני שיטות אחרות לבדיקת ריכוז החלבון:

1. שיטה פשוטה - בא דרוש רק ריאגנט אחד.

2. שיטה מהירה - תוך חמש דקות מתקבלת התוצאה.

3. הצבע נשאר יציב במשך שעה.

4. ריאקצית הצבע כמעט ואינה מושפעת מרוב החומרים הנמצאים בתמיסה.

הרצת החלבונים באלקטרופורזה - שיטת עבודה SDS - PAGE

מטרת השיטה: לבדוק את רמת הביטוי של החלבון על ידי עובי פס החלבון ורמת כהותו, שהתקבל במכשיר האלקטרופורזה (שיטה המאפשרת הפרדת חומרים המצויים בתערובת) .

תיאור השיטה: בשלב בשלב זה בודקים את רמת הביטוי של החלבון באלקטרופורזה בג'ל. כפעולה מקדימה נוסיף לחלבון SDS כדי להקנות לחלבון מטען שלילי ולשבור את קשרי המימן. בנוסף, נוסיף DTT שתפקידו לשבור את קשרי ה S-S. לאחר מכאן שמים את החלבון בהרתחה (100 מעלות) למשך 5 דקות וזאת על מנת שהחלבון יעבור דנטורציה והמבנה המרחבי שלו יהרס. שבירת הקשרים ותהליך הדנטורציה נועדו בכדי לשבור את המבנה המרחבי של החלבון על מנת שהחלבון ינוע רק ע"פ משקלו המולרי (40K.D) ולא ע"פ המבנה המרחבי.

נריץ בג'ל סימני גודל שהם חלבונים בעלי ריכוז ידוע, ובבארות האחרות את ה- PON1 תחת התנאים שבדקנו. החלבונים מטבעם הם חסרי צבע, לכן נוסיף חומר בשם coomassie - blue אשר נקשר טוב לחלבונים ומקנה להם צבע כחול לשם זיהוי החלבונים באלקטרופורזה בג'יל.

ככל שמולקולות החלבון קטנות יותר, תנועתן לעבר האלקטרודה החיובית מהירה יותר, ולהיפך. כך ניתן להפריד את החלבונים על פי גולם ולהעריך את גודלו של החלבון הרצוי על ידי השוואה לסמני גדול, ככל שהפס שמתקבל הוא עבה יותר ובעל צבע כהה יותר, סימן שרמת הביטוי גדולה של PON1.

תוצאות

כאשר ניקינו את החלבון בעזרת קולונות ניקל נשארנו עם PON1 כמעט טהור וכדי למצוא את הריכוז של החלבון שנותר השתמשנו בשיטת ברדפורד שבה בדקנו בכל מבחנה את רמת הבליעה ודרך עקומת כיול חישבנו את ריכוז החלבון .

טבלת תוצאות בדיקת רמת הבליעה בשיטת ברדפורד

Big image

*חישבנו את ריכוז החלבון בעזרת עקומת כיול המצורפת שניתנה ממכון ויצמן שממנה הוצאנו את משוואת הישר.

קביעת ריכוז החלבון נעשית באמצעות שימוש בנוסחא : Y=0.3264X

כאשר Y הוא ערך ה- O.D שנמצא (אותו הצבנו בנוסחא ).

X הוא ריכוז החלבון ב- mg/ ml.

לדוגמה: זמן הדגרה 180:

X=0.016/0.3264

X=0.049

Big image

**לחישוב כמות החלבון הכפלנו את נפח התמיסה בריכוז: נפח*ריכוז=כמות

לדוגמה : זמן הדגרה 180 :

כמות החלבון= 0.049*0.075

כמות החלבון=0.0037

Big image
לאחר שחישבנו את ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד, נרצה לבדוק את רמת הביטוי של החלבון PON1 במבחנות הנבדלות בזמן ההשריה של החלבון ב-IPTG בזמנים שמדדנו, בטווח של שלוש שעות כול חצי שעה עד לזמן האופטימלי. נבדוק זאת באמצעות שבירת המבנה המרחבי של החלבון והרצתו באלקטרופורזה בג'ל. ככל שהפס שיתקבל יהיה עבה וכהה יותר כך נדע שרמת הביטוי של החלבון היא גבוהה יותר.
Big image
כפי שניתן לראות מתוצאות ההרצה באלקטרופורזה בג'ל ישנם פסים בעובי שונה ובבהירות שונה.

כדי לזהות את הפס שמייצג את PON1 נשווה לסמן גודל שגודלו 40KD. הפסים שיימצאו באותו מיקום מבחינת מרחק ההרצה של סמן הגודל 40KD יצביעו על כמות החלבון PON1 שאת רמת ביטויו אנו בודקות ולכן נבדוק את פסים אלו.


ניתן לראות כי הפסים העבים ביותר והכהים ביותר נמצאים בזמנים של 150 ו-180 דקות . אחריהם הפסים הופכים דקים ובהירים יותר בהתאמה לזמן ההדגרה (120 ,90, 60, 30 דקות)

דיון בתוצאות ומסקנות

לפני ביצוע הניסוי ציפינו שכאשר נבדוק את ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד, נמצא כי בזמן ההדגרה הגבוה ביותר שנמדוד, ריכוז החלבון יהיה הגבוה ביותר (180 דקות). אולם, בניגוד לציפיותינו, לאור התוצאות מבדיקת ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד, גילינו שרמת הבליעה הגבוהה ביותר היא במבחנה בה השרינו את החיידקים במשך 120 דקות, לפיכך ניתן להבין כי במבחנה זו ריכוז החלבונים המופקים בתא היה הגדול ביותר. אנו משערות כי ההבדל בין השערתנו לבין התוצאות בשיטת ברדפורד נובע מכך שבבדיקה בשיטת ברדפורד בדקנו את כמותם של חלבונים שונים שהופקו בתא ולכן ריכוזו של PON1 ביחס לשאר החלבונים יכול היה להיות שונה. מכאן, יכול להיות שבזמנים 150 דקות ו- 180 דקות כמות החלבון PON1 הייתה גדולה יותר מאשר ב120 דקות שריכוז החלבונים שם היה גדול יותר.

השערתנו כי ככל שנשרה את החיידקים הרקומביננטים זמן רב יותר במשרן IPTG כך רמת ביטוי הגן המקודד ל- PON1 בוריאנט 8C8 תהיה גדולה יותר עד לזמן אופטימלי, אוששה כאשר ראינו את התוצאות בהרצה באלקטרופורזה בג'ל. כאשר הדגרנו את החיידקים זמן רב יותר במשרן IPTG,רמת הביטוי של PON1 הייתה גבוהה יותר. מכאן נסיק כי זמן ההדגרה האופטימלי לחיידקים במשרן IPTG בווריאנט 8C8 הוא 180 דקות.

זאת מכיוון שככל שהחיידקים היו מושרים זמן רב יותר במשרן IPTG, כך הסיכוי של ה-IPTG להיקשר לרפרסור היה גדול יותר. דבר זה הביא לכך שהסיכוי של מולקולות הרפרסור להיקשר לאתר המפעיל קטן וכך מבחינה מרחבית התאפשרה היקשרותו של הרנ"א פולימראז לאתר המקדם. הרנ"א פולימראז איפשר את היווצרותו של mRNA וכן תיעתוק החלבונים המבוקשים ללא גורם שיפריע, לכן רמת ביטוי החלבונים הייתה גדולה יותר. זמן ההדגרה בסופו של דבר לא השפיע על רמת הביטוי של PON1 מסיס ויעיל ויהווה גורם מגביל מכיוון שכאשר כמות ה-PON1 גדולה מאוד, החיידקים נוטים לסגור אותו בגופיפי הסגר. במצב זה PON1 הופך לצבר אשר אינו מסיס ואינו יכול לפעול ולפרק גז עצבים וכך רמת הביטוי של PON1 יעיל לפירוק גז עצבים תישאר קבועה.

הצעות לשיפור הניסוי: לאחר שגילנו שישנם אי דיוקים בניסוי שערכנו ועל מנת לשפר את דיוק התוצאות ומהימנותן יש לבצע חזרות על אותו ניסוי ולהשוות בין התוצאות שמתקבלות, וזאת כדי להבטיח את מהימנותן. כמו כן, לאחר שראינו את השגיאה בגרף שערכנו לבדיקת ריכוז החלבונים בתא, הסקנו כי בשלב ניקוי החלבונים בקולונת הניקל, נדרש דיוק רב על מנת לקבל הפרדה כמעט מוחלטת בין החלבון PON1 לשאר החלבונים.


הצעות לכיווני המשך: לאחר שגילנו כי סוג הוריאנט אינו משפיע על זמן ההדגרה האופטימלי לקבלת רמת ביטוי מקסימלית, נרצה לבדוק האם ישנה אפשרות ליצירת מוטציה בגן המקודד לאנזים PON1 אשר בזמן הדגרה קצר יותר, תתקבל רמת ביטוי גבוהה יותר.

התייחסות לקבוצת המחקר

Big image

דיון בתוצאות של קבוצת המחקר

כאשר השווינו את התוצאות לתוצאות של קבוצת המחקר שלנו, גילינו שבשיטת ברדפורד כמות החלבונים הגבוהה ביותר שהתקבלה שונה בין הניסוי שלנו לניסוי של קבוצת המחקר. ראינו שריכוז החלבונים הגבוה ביותר בוריאנט 8C8 שאנו בדקנו היה 120 דקות , לעומת קבוצת המחקר שלנו שבדקה את הוריאנט WT ומצאה כי ריכוז החלבון הגבוה ביותר התקבל לאחר 60 דקות. דבר זה כנראה נובע מכך שבעת ניקוי החלבון בקולונת ניקל, נשארו בקולונה חלבונים נוספים חוץ מPON1.

לכל וריאנט ישנו זמן הדגרה מסוים אחר שבו ריכוז החלבונים המופקים בתא החיידק הוא הגדול ביותר. וזאת ניתן לראות ע"פ הגרף המצורף. זאת מכיוון שהחיידקים הפיקו בכול וריאנט כמות חלבונים שונה שהשפיעו על רמת הבליעה של PON1.

כמו כן, כאשר השווינו את תוצאות ההרצה באלקטרופורזה בג'ל בשיטת SDS-PAGE, ניתן לראות כי לקבוצת הניסוי שלנו, שזמן ההדגרה של הוריאנטים השונים שנבדקו : 8C8, WT אינו משפיע על הזמן האופטימלי להדגרת החיידקים על מנת לקבל את רמת הביטוי הגבוהה ביותר. זאת מכיוון, שרמת הביטוי הגבוה ביותר של PON1 היה בזמן של 180 דקות לנו ולקבוצת המחקר שלנו.