ביוטק

השפעת ריכוז הסובסטרט על פעילות האנזים PON1 בחיידק E.coli

מגישים: ג'ייק סנדרס ואיתמר שני.

מנחה: דר' שמואל כהן.

בית-ספר: אמי''ת חברה ומשפט כפר בתיה רעננה.

מקום המחקר: מכון דוידסון – מכון ויצמן

שנה: 2015-2016.

מבוא:

המטרה שלנו בעבודת החקר הזו היא לחקור ולפתח את החלבון PON1 בחיידקים ולהפיק אותו.

אמנם העבודה שלנו היא תאורטית בלבד, אך באופן מעשי יש לנושא העבודה השפעה גדולה.
במאה שנה האחרונות, מלבד פיתוח ושכלול נשק חם כגון רובים ומכונות מלחמה, התפתחו גם נשקים מסוג לוחמה כימית.
גז העצבים שאותו פתחו הגרמנים במאה ה-20 השתכלל ונעשה כנשק לכל דבר. אמנם האו"ם אסר שימוש בנשקים מסוג זה, אך זה אינו מונע ייצור דרכים ואמצעים להתגונן מפניו, בייחוד למדינת ישראל, ששכנתה היא סוריה, השתמשת בגז עצבים נגד אזרחיה, וייתכן שיהיה בשימוש נגד ישראל.

פיתוח אמצעים כנגד נשק זה חיוניים ביותר, לכן חוקרים החלו לחקור אנזימים שישמשו כ"מטאטא ביולוגי" כנגד חומרים אלו, הפוגעים במערכת העצבים.
המחקר הנ"ל הינו אבן דרך חשובה בייצור אנזים זה, ופיתוח של האנזים PON1 יהוה פתרון לחשיפה לגז עצבים. פיתוח זה ייתן מענה לאלו שנפגעו מגז עצבים, ויחסוך אבדות בנפש.

עוד סיבה טובה לפתח אנזים זה היא מכיוון שהאנזים PON1 בעל יכולת מניעת טרשת עורקים, מחלה זו נפוצה מאוד בכל העולם וגורמת לתמותה מרובה.

תיאור מכון מחקר:

מכון ויצמן למדע ברחובות. מכון ויצמן למדע הוא אחד ממכוני המחקר הרב-תחומיים המובילים בעולם.

שורשיו של מכון ויצמן יונקים ממכון המחקר על שם דניאל זיו שהוקם בשנת 1934 בתרומתם של ישראל ורבקה זיו, מלונדון, שביקשו להנציח בדרך זו את זכרו של בנם דניאל. יוזם הקמתו של מכון זיו, הרוח החיה בפעילתו המדעית ונשיאו הראשון היה ד"ר חיים ויצמן, כימאי בעל שם עולמי שעמד במשך שנים רבות בראש התנועה הציונית ולימים היה לנשיאה הראשון של מדינת ישראל. בנובמבר 1944, בהסכמתה ובברכתה של משפחת זיו, הוחלט כי מכון זיו יעמוד בבסיסו של ארגון מדעי רחב היקף שייקרא על שמו של ד"ר חיים ויצמן. בשניים בנובמבר 1949, לכבוד יום הולדתו ה- 75 של חיים ויצמן, נחנך מכון ויצמן למדע.

בימיו הראשונים של מכון המחקר על-שם דניאל זיו מנה הצוות של ד"ר ויצמן כעשרה מדענים בלבד. כיום עובדים במכון מעט יותר מ-2,700 בני-אדם. כ-1,000 מדענים וחברי קבוצות מחקר, כ-1,100 תלמידי מחקר, כ-220 חוקרים בתר-דוקטוריאליים וכ-400 עובדי מינהלה. במכון פועלות כ-250 קבוצות מחקר, בראשות חוקרים בכירים ופרופסורים.

המכון מחולק לחמש פקולטות: מתמטיקה ומדעי המחשב, פיסיקה, כימיה, ביוכימיה ופיסיקה. הפקולטות נחלקות ל-17 מחלקות מדעיות. לאלה נוספים מדרשת פיינברג, שהיא הגוף האוניברסיטאי של המכון, המכשיר תלמידי מחקר לתארים מתקדמים בלבד.

כרטיס ניסוי מכין

בניסוי המכין עשינו טרנספורמציה לחיידקי E.coli עם פלסמיד המכיל את הגן המקודד לאנזים pon1, מהוריאנט 8C8.

בשיטה הנקראת ''שוק תרמי'' אנו מחדירים את הפסלמיד הרצוי לחיידקי E.coli , אנו מעבירים את חיידקי E.coli מטמפרטורות קיצוניות, מחום קיצוני לקור קיצוני, על מנת להפוך את הדופן שלהם לחדירה על ידי הפלסמיד המכיל את הגן הרצוי. לאחר מכן, הוספנו לתמיסה את הפלסמיד, והמתנו שעה בשביל שהפלסמיד ייכנס לתאי החיידקים.

לאחר שהפלסמיד חדר לתא החיידק, ביצענו בקרה על מנת לבדוק האם התקיימה טרנספורמציה. מראש, החדרנו לפלסמיד בו נמצא הגן לאנזים גן המקודד לעמידות לאנטיביוטיקה מסוג אמפיצילין. זרינו את תמיסת החיידקים על שתי צלחות אגר: אחת המכילה את האנטיביוטיקה אמפיצילין ואחת שלא, ובנוסף לזה, הוספנו מים לצלחת המכילה אגר ואמפיצילין לצורך בקרה. אנו מצפים שבצלחת האגר המכילה אמפיצילין ותמיסת חיידקים יגדלו מושבות רבות, מכאן שיש להם עמידות לאמפיצילין והפלסמיד חדר לחיידק. הצלחת האגר ללא האמפיצילין המכילת תמיסת חיידקים נצפה לגדילת מרבד חיידקים, מאחר ששום דבר לא מגביל אותם. ובצלחת האגר המכילה אמפיצילין והוספנו לה מים, נצפה שלא יגדלו מושבות כלל.

Big image

דו''ח מחקר

שאלת מחקר: מהי השפעת ריכוז הסובסטרט בחיידקי E.coli, על פעילות האנזים pon1 מהוריאנט 8C8.

משתנה בלתי תלוי: ריכוז הסובסטרט.

משתנה תלוי: פעילות האנזים pon1.

בקרה: בקרה פנימית.

חזרות: 2 חזרות.

גידול החיידקים:

לאחר שלב הטרנספורמציה בו מכניסים את הפלסמיד שמכיל את הגן לאנזים Pon1 ומבודדים את החיידקים שקלטו את הפלסמיד ע''י טיפול אנטיביוטי. מוסיפים דוגמה מן החיידקים שקלטו את הפלסמיד למצע הגידול LB, ושמים אותם באינקובטור בC37 מעלות ותוך כדי טלטול.

את התרבית נגדל עד אמצע השלב הלוגריתמי (שלב הגידול), עד לOD 0.6-0.8.

הפעלת הגן המקודד ל Pon1:

בפלסמיד איתו אנו עובדים, הגן המקודד לאנזים המבוקש נמצא תחת בקרת אופרון הלקטוז. על מנת לבטא את הגן נוסיף אנלוג של לקטוז הנקרא IPTG. הסיבה שאנו משתמשים באנלוג של לקטוז ולא בלקטוז על מנת להפעיל את אופרון הלקטוז היא מפני שמערכת אופרון הלקטוז עובדת כך שהחיידק מפרק הלקטוז יפרק את הלקטוז עד שמערכת אופרון הלקטוז תעצור את ביטוי הגן. אך לעומת הלקטוז, IPTG מפעיל את ביטוי הגן אך החיידק מפרק החלבון לא יכול לפרק אותו, ולכן רמתו תישאר קבועה וביטוי הגן לא ייפסק. יתרון נוסף הוא שהIPTG לא תלוי באנזים LacY על מנת להיכנס לתא החיידק.

הפקת החלבון:

פיצוץ התאים: לאחר ביטוי החלבון יש צורך להוציא את האנזים pon1 מהתאים. זאת עושים על ידי Bugbuster, שהוא תמיסה כימית המפרקת את דופן התא. מוסיפים לתמיסה גם ליזוזים, דטרגנט ונוקלאזות. אנזימים המפרקים את התא וחומריו. יש חשיבות גם לשמור על יציבות החלבון הרצוי. ולהוסיף מעכב פרוטאזות המונע את פירוק האנזים המבוקש על ידי הפרוטאזות.

סרכוז החלבון: לאחר פיצוץ תאי החיידקים מתקבלת תמיסה המכילה שברי תאים והנוזל הפנימי שלהם, על מנת להפריד בין שברי התאים לנוזל, אנו שמים את המבחנה בצנטריפוגה, והצנטריפוגה מפרידה בין ממס למומס עפ''י משקלם הסגולי.

ניקוי החלבון: הנוזל שהתקבל מסרכוז התאים מכיל את התאים . ההפרדה בין החלבון הרצוי (pon1) לשאר התמיסה מתבצעת על ידי העברת התמיסה בקולונה. לגן שהחדירו לפלסמיד עשו איחוי עם פפטיד הכולל רצף של 8 היסטדינים. הקולונה בה אנו משתמשים היא צינור שלדפנותיו מודבקים חרוזי ניקל, ולהיסטדינים שמחוברות לחלבון יש זיקה לחרוזי הניקל, כך שכשנעביר את התמיסה בקולונה, כמעט ורק חלבוני הpon1 יישארו בקולונה ושאר התמיסה תשטף החוצה. לאחר מכן אנו מוסיפים בופר שטיפה בריכוז אימידאזול מסויים כך שהוא מתחרה על הקישור לחרוזי הניקל עם חלבונים לא רצויים שהיו בתמיסה ומקורם מהחיידקים. לאחר מכן מוסיפים בופר שיחרור שריכוז האימידאזול בו גבוה מבופר השטיפה כך שהוא מתחרה עם חלבון הpon1 על הקישור לחרוזי הניקל וכך משחרר את הpon1 מהקולונה. את מיצוי הקולונה אספנו ב5 מבחנות

בדיקת ריכוז אנזים:

לקחנו דגימה מכל אחת מ5 המבחנות והוספנו אוה בתוספת של ברדפוקד ומים מזוקקים לקיווטה. אנו משתמשים ב ''שיטת ברדפורד'', בשיטה זו אנו מוסיפים חומר צובע הנקרא ברדפורד, ולפי עוצמת הצבע אנו בודקים בספקטרופוטומטר באיזו קיווטה נמצא ריכוז האנזים הגבוה ביותר.

בדיקת פעילות:

על מנת לבדוק את רמת הפעילות של האנזים שלקחנו מהמבחנה בעלת ריכוז האנזים הגבוה ביותר אנו משתמשים במכשיר הנקרא plate reader, הקורא בליעה, אנו משתמשים בפלטת באריות, בשתי שורות של באריות אנו שמים סובסטרט בריכוזים שונים, ובשורה נוספת אנו שמים את האנזים בריכוז זהה. לאחר מכן, אנו מעבירים את האנזים בזריזות לבאריות שמכילות את הסובסטרט, ומיד שמים את הפלטה במכשיר, שמודד את הבליעה בבאריות כל 5 שניות למשך 5 דקות. הסובסטרט בו אנו משתמשים הוא פאראוקסון המשמש כחומר הדברה, וכאשר pon1 מפרק אותו, התוצר שלו בצבע צהוב, כך שככל שיש יותר תוצר הצבע הצהוב חזק יותר, וזה מה שמשנה את עוצמת הבליעה.

Big image

מסקנות

בעבודה זו, בחרנו לבחון האם לריכוז הסובסטרט יש השפעה על פעילות האנזים PON1 מהווריאנט 8C8 בחיידקי E.coli.

נמצא כי קצב פעילות האנזים PON1 מהווריאנט 8C8 הוא בעל קצב הפעולה הגבוה ביותר, אנזים זה מגיע לקצב הגבוה יותר בריכוזי הסובסטרט הקטנים ביותר

קבוצות אחרות בדקו את השפעת ריכוז הסובסטרט על פעילות האנזים PON1 בחיידקי E.coli מווריאנטים אחרים (W.t. ו- H115W).

Big image

ניתן לסייג את התוצאות מאחר ולא עשינו חזרות, אלא רק ריבוי פרטים.

בניסוי המשך נבצע חזרות על כל הפרוטוקול, ונבדוק את השפעת ריכוז הסובסטרט על פעילות האנזים PON1 מווריאנטים שונים בחיידקים שונים.