עבודת הביוטק

אלעד צוברי וישי אדלשטיין

מבוא

המטרה שלנו בעבודת החקר הזו היא לחקור ולפתח את החלבון PON1 בחיידקים ולהפיק אותו. אמנם העבודה שלנו היא תאורטית בלבד, אך באופן מעשי יש לנושא העבודה השפעה גדולה על ההגנה של בני האדם.
במאה שנה האחרונות, מלבד פיתוח ושכלול נשק חם כגון רובים ומכונות מלחמה, התפתחו גם נשקי אב"כ (אטומי ביולוגי וכימי).
גז העצבים שאותו פתחו הגרמנים במאה ה-20 השתכלל ונעשה כנשק לכל דבר. נשק זה הרסני מאוד ועלול לגרום לנזקים איומים לבני אדם בשימוש בו.
אמנם האו"ם אסר שימוש בנשקים מסוג זה, אך זה אינו מצריך מהעולם אפשרויות ודרכים להתגונן מפניו, בייחוד למדינה כמו ישראל שהשכנה שלה, סוריה, משתמשת בגז עצבים על אזרחיה וזה עלול גם להגיע כנגד ישראל.

פיתוח אמצעים כנגד נשק זה חיוניים ביותר, לכן חוקרים החלו לחקור אנזימים שישמשו כ"מטאטא ביולוגי" כנגד החומרים האלו.
המחקר הנ"ל הינו אבן דרך חשובה בייצור אנזים זה, ופיתוח מלא של האנזים PON1 צריך לתת לנו הגנה כנגד זה. פיתוח זה יכול לעזור ולתת הגנה לכל העולם ולחסוך המון נזק ואבדות בנפש.

עוד סיבה טובה לפתח אנזים זה היא מכיוון שהאנזים PON1 בעל יכולת מניעת טרשת עורקים, מחלה זו נפוצה מאוד בכל העולם וגורמת לתמותה מרובה. פיתוח אנזים זה יתרום למניעת מחלה זו.

כרטיס ביקור - מכון ויצמן למדע


מכון ויצמן למדע ברחובות. מכון ויצמן למדע הוא אחד ממכוני המחקר הרב-תחומיים המובילים בעולם.

שורשיו של מכון ויצמן יונקים ממכון המחקר על שם דניאל זיו שהוקם בשנת 1934 בתרומתם של ישראל ורבקה זיו, מלונדון, שביקשו להנציח בדרך זו את זכרו של בנם דניאל. יוזם הקמתו של מכון זיו, הרוח החיה בפעילתו המדעית ונשיאו הראשון היה ד"ר חיים ויצמן, כימאי בעל שם עולמי שעמד במשך שנים רבות בראש התנועה הציונית ולימים היה לנשיאה הראשון של מדינת ישראל. בנובמבר 1944, בהסכמתה ובברכתה של משפחת זיו, הוחלט כי מכון זיו יעמוד בבסיסו של ארגון מדעי רחב היקף שייקרא על שמו של ד"ר חיים ויצמן. בשניים בנובמבר 1949, לכבוד יום הולדתו ה- 75 של חיים ויצמן, נחנך מכון ויצמן למדע.

בימיו הראשונים של מכון המחקר על-שם דניאל זיו מנה הצוות של ד"ר ויצמן כעשרה מדענים בלבד. כיום עובדים במכון מעט יותר מ-2,700 בני-אדם. כ-1,000 מדענים וחברי קבוצות מחקר, כ-1,100 תלמידי מחקר, כ-220 חוקרים בתר-דוקטוריאליים וכ-400 עובדי מינהלה. במכון פועלות כ-250 קבוצות מחקר, בראשות חוקרים בכירים ופרופסורים.

המכון מחולק לחמש פקולטות: מתמטיקה ומדעי המחשב, פיסיקה, כימיה, ביוכימיה ופיסיקה. הפקולטות נחלקות ל-17 מחלקות מדעיות. לאלה נוספים מדרשת פיינברג, שהיא הגוף האוניברסיטאי של המכון, המכשיר תלמידי מחקר לתארים מתקדמים בלבד.

בנוסף קיים מכון להוראת המדעים -מכון דוידסון – אשר במסגרתה בצענו את הביוטק. מכון זה מפעיל תוכניות רבות המכוונות לתלמידים, למורים ולציבור הרחב, במטרה לחלוק עם הציבור את החוויה המדעית, ולהקנות כלים להבנה של התפתחויות מדעיות וטכנולוגיות.

יעד חשוב של מכון ויצמן הוא העברה של ממצאים מחקריים וידע אקדמי שמצטבר על ידי מדעני המכון ליישומים מעשיים לשיפור הבריאות ורמת החיים. לצד המכון הוקם חברת "ידע", העוסקת בקידום יישומים תעשייתיים על בסיס המצאותיהם של מדעני המכון הוקמה בשנת 1959. מאז הייתה מעורבת ברישום של כ-1,400 משפחות פטנטים. מאז שנת 1973 חתמה "ידע" על 169 הסכמים עם חברות ישראליות לניצול הפטנטים השונים, והקימה 42 חברות (21 מתוכן הוקמו משנת 2000 ואילך). ניתן לקבל תמונה על חשיבות פיתוחי מדעני המכון מהדוגמאות הבאות:

· בדיקת מי שפיר המשמשת לבדיקת מאפיינים גנטיים של עוברים.

· כרומטוגרפיית זיקה - שיטה להפרדת חומרים ביולוגיים, המשמשת כלי מרכזי בתעשיית הביוטכנולוגיה.

· מבנה ריבוזום- גילוי מבנה הריבוזום, בית חרושת לחלבונים של התא, המחקר והבנת עקרונות פעילותו, זיכו את פרופ' עדה יונת, מהמכון, בפרס נובל לכימיה. מחקר זה עשוי לאפשר פיתוח תרופות אנטיביוטיות שיהיו יעילות גם נגד חיידקים שפיתחו עמידות לתרופות קיימות.

· תרופות - מספר תרופות שפותחו במכון נמצאות בשימוש בארצות ברחבי העולם; בהן תרופת הקופקסון, המיוצרת על ידי חברת "טבע", פותחה בידי צוות חוקרים במכון ויצמן, ונחשבת לאחת הטובות ביותר המצויות כנגד מחלת הטרשת הנפוצה; ארביטוקס - תרופה אנטי סרטנית המיועדת לטיפול בסרטן גרורתי של המעי הגס ובסרטן ראש צוואר.[3] הם המציאו את התרופה "רביף", המיוצרת ומשווקת על ידי חברת "סרונו"; ותרכיב חיסון חדש לדלקת כבד נגיפית (הפטיטיס B), שיוצר ושווק על ידי "ביוטכנולוגיה כללית".

· השתלת לשד העצם - שיטה מקורית להשתלת לשד עצם מתורם לא תואם, מיושמת במספר בתי חולים בארץ ובעולם, וכך גם שיטה מתקדמת, ולא חודרנית, להבחנה בין גידולים סרטניים לבין גידולים שפירים, באמצעות תהודה מגנטית.

· חקלאות- מדעני המכון פיתחו זנים שונים של גידולים חקלאיים משופרים: חיטה עשירה בחלבון ועתירת יבולים, מלונים שמקדימים להבשיל, מלפפוני דלילה עמידים כנגד מחלות.

כרטיס ביבליויגרפי מאמר מקדים

· Harel,M.,Aharoni, A.,Gaidukov, L., Brumshtein, B., Khersonsky,O.,Meged,R., Dvir, H., Ravelli, R.B.G., Mccarty, A., Toker, L., Silman,L., Sussman, J., 2004. Structure and evolution of the serum paraoxonase family of detoxifying and anti- atherosclerotic enzymes. Nat. Strut.Mol.Biol. 11, 412-419.

· Rochu,D.,Chabriere,E.,Masson,P.,2007.Human paraoxonase: A promising approach for pre-treatment and therapy of organophosphorus poisoning. Toxicology. 233, 47-59.


ביטוי ואפיון של האנזיםPON1 ככלי ביוטכנולוגי לפירוק גז עצבים (מאמר מאוחד)


גז עצבים הינו תרכובת ארגנו-זרחתית המעכבת את פעילותו של האצטילכולין במערכת העצבים וכך גורמת לשיבוש הגירויים העצביים המובילים לכיווצי שרירים ולהפרשות מבלוטות ואף למוות. כדי להתמודד עם נשק זה, חוקרים מנסים להשתמש בשיטת ה"מטאטא הביולוגי", שיטה שבה נעשה שימוש באנזימים כדי לפרק רעלנים מגוף האדם. אחד החלבונים שיכולים לפרק גז עצבים נקרא PON1, חלבון זה מצוי ביונקים והוא משמש לפירוק של תרכובות ארגנו-זרחתיות. בהתחלה ניסו להפיק חלבון זה מסרום של אדם אך הכמויות שהתקבלו היו קטנות ולא יעילות וכל היה צורך לפתח אנזים זה. החוקרים ביצעו אבולוציה מכוונת על חלבון זה כדי למצוא את המוטנט הכי יעיל של החלבון כדי שישמש מטאטא ביולוגי בגוף האדם. לאחר ערבוב גנים מכמה בע"ח נמצא בגן הרקומביננטי הטוב ביותר.
החוקרים החדירו את הגן לפלסמיד ואת הפלסמיד לחיידקי Ecoli. לאחר מכן ביטאו את הגן באמצעות מערכת הבקרה של אופרון הלקטוז, וניקו ובידדו את הגן באמצעות קולונת ניקל.
נבדקה רמת הפעילות של החלבון, נעשו ניסויים של עכברי מעבדה שנועדו לבדוק את פעילות החלבון גם ביחס למוטנטים שונים שהתקבלו באבולוציה מכוונת.

כרטיס ביבליויגרפי מאמר שני

http://www.sciencedaily.com/releases/2008/09/080924162936.htm

Researcher Working On Destruction of Chemical Weapons

Texas A&M University, 2008


הלוחמה בטרור של ארה"ב כוללת בתוכה גם לוחמה באמצעי נשק כימיים כגון גזי עצבים. ישנם שני סוגי גזי עצבים: סארין ו- VX.
גז הסארין הינו תרכובת ארגנו-זרחתית המעכבת את פעילות האצטילכולין אסטראז ובכך גורמת לפגיעה ביכולת של מערכת העצבים לפקד על השרירים בגוף האדם, דבר שמוביל לכיווץ שרירים, קשיי נשימה, אי שליטה על סוגרים ולבסוף למוות. גז הסארין נחשב כקטלני מאוד, פי 500 מגז הציאניד הידוע כקטלני בעולם כולו.
הגז VX פועל בדומה לגז העצבים סארין, אך הוא אינו נידף, אלא עמיד, וניתן לגלות אותו רק באמצעות מכשירים טכנולוגיים מתקדמים (בשונה מהסארין בעל הצבע החום), דבר זה הופך אותו ליותר מסוכן מהסארין.
חוקרים גילו אנזים שמקורו חיידקי ושמו phosphotriesterase, אשר מסוגל לזהות ולנטרל את רעילותם של מגוון חומרים זרחנים אורגאניים המשמשים כגזי עצבים.
מטרתו של החוקר הינה לתכנן ולאפיין אנזימים חיידקיים כאלו שיהיו טובים יותר בזיהוי, נטרול וחיסול החומרים המהווים את הסכנה הגדולה ביותר לבריאות הציבור.

ניסוי מכין (ניסוי פרמלינרי)

מטרת הניסוי

להחדיר פלסמידים עם הגן המקודד ל- PON1 לחיידקי E.coli ולהרבות אותם בצלחות פטרי

שיטות וחומרים

קיבלנו שתי מבחנות עם חיידקי E.coli בתוכן. ומבחנה אחת עם פלסמידים עם גן הווריאנט W.t.. בפלסמיד היה אזור המקודד לגן לעמידות לאנטיביוטיקה אמפיצילין. על אחת מבחנות החיידקים רשמנו "בקרה" והוספנו אליה מים מזוקקים. על המבחנה השניה של החיידקים רשמנו "ניסוי" והוספנו אליה פלסמידים.
כדי שהפלסמידים יוחדרו לתוך החיידקים, נתנו לחיידקים "שוק תרמי", כלומר שמנו אותם בקרח כתוש למשך 10 דקות ולאחר מכן שמנו אותם בחום (42 מעלות צלזיוס) למשך דקה ואז שוב העברנו אותם לקרח.
ואז שמנו את המבחנות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

קיבלנו שלוש צלחות פטרי (מצע אגר). שתי צלחות מרחנו באנטיביוטיקה אמפצילין ואחת השארנו רק עם אגר.
את מבחנת ה"ניסוי" חלקנו בין הצלחת עם רק האגר (בקרה חיובית) לצלחת עם אגר ואמפיצילין (ניסוי).
את מבחנת ה"בקרה" שמנו בצלחת עם אגר ואמפיצילין (בקרה שלילית).

למחרת קיבלנו את תוצאות ההדגרה.

תוצאות

למחרת ההדגרה קיבלנו את תוצאות הניסוי:

בצלחת האגר בלבד (מבחנת הניסוי, צלחת הבקרה החיובית) גדלו המון חידקים (שטיח של חיידקים). זאת משום שגם כולם קיבלו פלסמיד וגם כולם שרדו כי לא הייתה אנטיביוטיקה שיכולה לחסל את החיידקים.

בצלחת האגר והאמפיצילין הראשונה (מבחנת הניסוי, צלחת הניסוי) גדלו מושבות של חיידקים, זאת משום שחלק מהחיידקים קיבלו את הפלסמיד ולכן שרדו באנטיביוטיקה וחלק לא קיבלו את הפלסמיד ומתו באנטיביוטיקה.

בצלחת האר והאמפיצילין (מבחנת הבקרה, צלחת הבקרה השלילית)לא גדל כלום. זאת משום שהחיידקים לא קיבלו את הפלסמיד (במבחנת הבקרה הוספנו מים) ולכן כולם מתו באנטיביוטיקה.

Big image

1. מבחנת הניסוי, צלחת הבקרה השלילית
2. מבחנת הניסוי, צלחת הניסוי

3. מבחנת הבקרה, צלחת הבקרה השלילית

מסקנות

מהניסוי הסקנו שחיידקים שאינם בעלי עמידות לאנטיביוטיקה אינם יכולים לגדול על מצע אנטיביוטי. עשינו זאת כיוון שהאנטיביוטיקה היא הסימן ברירה של הפלסמיד עם הגן של החלבון PON1 וכדי שנוכל לברור את החיידקים בעלי הפלסמיד (שגם יוכלו לבטא את הגן) החדרנו את הפלסמיד עם העמידות לאנטיביוטיקה והגדרנו את החיידקים על מצע אנטיביוטי, וכמו בתוצאות הניסוי, רק החיידקים עם העמידות לאנטיביוטיקה שרדו.

דו"ח המחקר

שאלת המחקר

השפעת ריכוזים שונים של הסובסטרט, בחיידקי E.coli, על פעילות האנזים PON1 מהווריאנט W.t.


- משתנה בלתי תלוי: ריכוזים שוני של סובסטרט Paraoxon (0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.75,3.50,4.25)
- משתנה תלוי: קצב פעילות האנזים (נמדד ע"י ערכי הבליעה)

- בקרה: בקרה פנימית, כל ריכוז היה בקרה לריכוז הבא

- חזרות: שמנו את ריכוזי הסובסטרט בשתי שורות שונות ושמנו את החלבון בכל שורה. ביצענו כביכול את הניסוי פעמיים, כדי שנוכל לסמוך על השורה השנייה במקרה שמשהו בושרה אחת נהרס

שיטות וחומרים

ביטוי הטרנסגן של PON1 בחיידקים
לאחר הטרנספורמציה והחדרת הפלסמיד לחיידקים רצינו לבטא את הגן שהוחדר. לכן הוספנו אנלוג של לקטוז (IPTG) לשם הפעלת מערכת הבקרה לגן- אופרון הלקטוז.
לכאורה, היינו יכולים להוסיף לקטוז רגיל, אך בחיידקים האלו הלקטוז יפורק ולא יעבוד לאורך זמן, לכן הוספנו אנלוג של לקטוז כדי שלא יפורק.
הדגרנו את החיידקים באנלוג הלקטוז וחיכינו זמן לביטוי הגן.


הפקת החלבון

פיצוץ כימי של החיידקים
לאחר ביטוי החלבון יש לשחררו מתאי החיידקים, לשם כך פוצצנו את החיידקים עם חומר הנקרא Bug buster, חומר זה מכיל אנזים מפרק דופן, סבון ומפרקי DNA ולכן חומר זה פירק את דופן תא החיידק. לתמיסה זו הופנו כל מיני מרכיבים העוזרים בפירוק מרכיבי התא

סרכוז
לאחר פיצוץ החיידקים קיבלנו תמיסה עם חומר מסיס (שאנחנו צריכים כי החלבון נמצא בו) וחומר לא מסיס (שאיננו צריכים). לאחר מכן סירכזנו את התמיסה ע"י צנטריפוגה למשך כמה דקות וכשהוצאנו אותה החומר הלא מסיס שקע למטה והחומר המסיס עלה למעלה. החומר המסיס מכיל בתוכו את ה- PON1.

ניקוי החלבון

א. הטענה
גם לאחר הסרכוז עדיין לא בודדנו את ה- PON1 , לכן עלינו לנקות את החלבון בקולונת זיקה. לקחנו קולונה והטענו אותה בחרוזי ניקל הטעונים חיובי. חלבון ה-PON1 מכיל זנב של היסטדינים הטעונים שלילי כיוון שהנדסנו את הגן כדי שיכיל את אלה.
לאחר מכן הטענו את הקולונה בתמיסה המסיסה שקיבלנו מהסרכוז וההיסטדינים השליליים נקשרו לחרוזי הניקל החיוביים.

ב. שטיפה
כדי לנקות את החלבון משאר החומרים שהיו איתו בתמיסה הוספנו בופר שטיפה (בעל ריכוז אימידזול נמוך) שישטוף את כל החומרים שעם החלבון.
לאחר כמה שטיפות הופסנו בופר מיצוי (בעל ריכוז אימידזול גבוה) שישחרר את ה-PON1 מחרוזי הניקל.

ג. מיצוי
אימידזול הוא חומר שגם יכול להיקשר לחרוזי הניקל, ולכן כשהוספנו בופר שטיפה (בעל ריכוז אימידזול נמוך) האימידזול לא התחרה בהיסטדינים על חרוזי הניקל ולכן רק שטף את הלכלוכים האחרים בתמיסת החלבון. אך כשהוספנו בופר מיצוי (בעל ריכוז אימידזול גבוה) אז האימידזול התחרה בהיסטדינים על הקישור לחרוזי הניקל ועל ידי כך גרם לשחרור ההיסטדינים מחרוזי הניקל ובכך מיצה את החלבון PON1.

מיצינו את החלבון עם בופר המיצוי כמה פעמים ושחררנו את ה- PON1 הנקי לתוך 5 מבחנות.


בדיקת החלבון
כעת רצינו לבדוק באיזו מבחנה שאליה מיצינו את החלבון PON1 יש את הריכוז הכי גבוה של החלבון. לשם כך לקחנו כמה קיווטות למדידה בספקטרופוטומטר. שמנו בכל קוייטה מעט חלבון שמיצינו (בכל קיווטה ממבחנה אחרת), מים מזויקקים ותמיסת Bradford.
ואז קראנו את ערכי הבליעה בספקטרופוטומטר. על ידי נוסחה שהתקבלה בעקום הכיול שהוכן מראש לשם מציאת הריכוזים ע"י ערכי הבליעה מצאנו שריכוז החלבון הכי גבוה נמצא במבחנה השנייה שמיצינו (E2).


בדיקת פעילות PON1
לאחר בדיקת החלבון, רצינו לבדוק את רמת הפעילות של החלבון PON1 מהמבחנה E2. קיבלנו ריכוזים שונים של אנלוג של גז העצבים (paraoxon) ומשטח של באריות. שמנו בכל בארית בשורה ריכוז שונה של האנלוג של גז העצבים (שורה A בארית 1- 0.25 מ"ג/מ"ל, בארית 2- 0.50 מ"ג/מ"ל וכן הלאה). עשינו את זה בשתי שורות לשם בקרה ולמקרה שיהיו טעויות.
בשורה אחרת שמנו בכל בארית חלבון PON1 מספיק לפעילות בשתי הבאריות.

Big image

לאחר מכן המדריך, ע"י מולטי פיפטור הכניס את החלבון לכל אחד מהבאריות בשתי השורות ומיד שם את המשטח במכשיר שבדק את רמת הפעילות ע"י בדיקת הבליעה של האנלוג.

המכשיר מדד את הבליעה בכל חמש שניות ורשם את תוצאות הבליעה של כל בארית בכל שורה. את הנתונים לקחנו ועיבדנו.

תוצאות

Big image

הגרף מתאר את ערכי הבליעה כפונקציה של הזמן.
ניתן לראות בגרף שבמהלך הזמן, ערכי הבליעה עולים (כלומר יש יותר פעילות אנזימתית ופירוק הסובסטרט) וגם ניתן לראות שככל שריכוז הסובסטרט יותר גבוה כך גם ערכי הבליעה יותר גבוהים.

Big image
הגרף הבא מתאר את קצב פעילות האנזים כפונקציה של ריכוז הסובסטרט.
בגרף הקודם נוצרו קווים לינארים לכל מבחנה (y) ולכן שיפוע הקו הוא קצב הפעילות של האנזים, ומשם נלקחו הערכים של קצב הפעילות לגרף הזה.

מסקנות

בניסוי זה רצינו לבדוק את הפעילות הכי טובה לאנזים PON1, כל קבוצה בדקה ווריאנט אחר. אנחנו בדקנו את הווריאנט W.t., קבוצות אחרות בדקו ווריאנטים אחרים. אולם מהשוואה של פעילות האנזים מהווריאנטים השונים נמצא כי האנזים מהווריאנט 8C8 מגיע לקצב הכי גבוה בריכוזים נמוכים.

Big image
ניתן לסייג את המוצאות מכיוון שלא עשינו מספיק חזרות.
בתור ניסוי המשך אפשר לעשות עוד חזרות או בדיקה נוספת בחיידקים אחרים/ווריאנטים שונים.