עבודת ביוטק

מגישות: קטי שפילר וריטה לוריא

שאלת חקר

כיצד כמויות שונות של כורכמין וטטרזין ישפיעו כל הצטברות P53 בתאי פיברובלסטיים (תאי ראות של אדם)?

מהלך המחקר

מהלך הניסוי

בראשית קיבלנו מס' צלחות עם מצע ותנאים אופטימליים לגידול תאים פיברובלסטים, לכל צלחת הוספנו צבעי המאכל שונים- טטרזין עם lµ100 אתאנול, כורכומין עםl µ200 אתאנול ובקרה עם lµ100 אתאנול. ושמנו אותם באינקובטור.

לאחר 20 שעות באינקובטור עלינו היה לאסוף את התאים ולהכניסם להרצה בג'ל.

לשם כך ביצענו מספר שטיפות עם PBS. לאחר השטיפות הוספנו טרפסין למבחנות והכנסנו לטמפ' מעט גבוה מטמפ' החדר לאינקובטור ל5 דקות. לאחר הוצאת הצלחות מהאינקובטור התאים נראו לעין בתרחיף ועלינו היה לגרדם ולהעביר לאזור מסוים. את נוזל הטרפסין עם התאים סירכזנו בצנטרפוגה למס' דקות בכדי שהתאים ישקעו. כעת שהתאים נמצאים בתחתית המבחנה אנו יכולים להפרידם להפרידם מהנוזל ומוסיפים בופר פיצוץ לתאים שמטרתו "לפוצץ" את קרום התאים ובכך לאפשר לחלבונים ולפנים התא לפרוץ מקרומי התא החוצה אל הנוזל.

חשוב לציין שעל מנת ליעל את פעילותו של הבופר ערבבנו את הנוזל בוורטקס וגרמנו לשינו טמפ' קיצוניים(להכניס לקרח ולהרתיח).החלבונים השתחררו כעת לנוזל ועכשיו נעביר את הנוזל עם החלבון למבחנות אפנדורף.

כעת עלינו להריץ את תערובת החלבונים בג'ל על מנת להפריד אותם.

לכל מבחנת אפנדורף מוסיפים נוזל הרצה בג'ל ומערבבים מעט בוורטקס, מרתיחים את המבחנות לשתי דק' ב100 מעלות ומסרכזים על מנת להחזיר את כל התמיסה אל תחתית המבחנה.

כעט מכינים את הג'ל עצמו להרצה, ומניחים במתקן ההרצה.

כאשר הכל מוכן מטעינים את את הדוגמות, שופכים לבאריות בופר ההרצה ומטעינים בזהירות מכל דוגמה בבארית נפרדת.

נותנים לג'ל לרוץ כשעה ולאחר מכן עוברים לשיטת תספיג חלבונים.

מניחים נייר סופג מיוחד על גבי הג'ל ומוודאים שאין בועות ומפעילים את המכשיר, לאחר מספר דקות מוסיפים תמיסת פונסו להעברת זרם חשמלי, מצלמים ושוטפים את התמיסה פעמיים עם T-TBS. על מנת למנוע קישור לא ספציפי של הנוגדן מוסיפים תמיסת חסימת קישור- תמיסת חלב.

את תמיסת השטיפה שופכים ומוסיפים את הנוגדן הראשון. שופכים את התמיסה ומכסים את הממברנה בתמיסת שטיפה, חוזרים על הפעולה מס פעמים.

כעט מבצעים פעולות זהות אך עכשיו מוסיפים את הנוגדן השיניוני- הניתן למעקב.

כדי לבצע את ראקציית המעקב מוסיפים לממברנה תמיסת סובסטראט (כמובן לאחר ששפכנו את תמיסת השטיפה), עכשיו נוכל לעקוב לאחר התפתחות הצבע השחור ולתעד במצלמה. והאמצעות מצלמה מיוחדת נוכל לקבל את עוצמת הצבע בפסים השחורים.

התספיג המערבי

לאחר מכן הכנו את התספיג המערבי שבו ראינו את השינויים בp53 שחלו בתאים השונים לפי העקות השונות שהפעלנו.

GAPDH זהו חלבון המופיע בכל התאים וחשיפה לעקות לא משפיעות על כמותו בתא.

זיהינו את P53 ןGAPDH על פי סימני הגודל.
בתמונה רואים שבטטרזין הקו השחור של P53 הרבה יותר כהה מקו הביקורת ומקו הכוכרמין. והקווים של GAPDH חוזקת הצבע דומה אצל כל שלושת העקות.

מסקנות הניסוי

בתאי פיברופלסטיים מריאת אדם שנחשפו לצבע מאכל כוכרמין הצטברות P53 או היחס P53/GAPDH ירדה אצלם ביחס לתאי הביקורת שלו, תאי הביקורת היו עם µl100 אתאנול.

התאי שנחשפו לצבע מאכל טטרזין הצטברות P53 עלתה אצלם ביחס לתאי הביקורת.

מתוצאות הניסוי אלו אנו יכולים לשער שצבע מאכל טטרזין מהווה שגורם למוטציות בDNA אשר גורמות ליצירה של חלבונים אשר מתקנים את הDNA או מוצאים את התא לאוופטוזיס. יש להתייחס לבקרה החיובית בניסוי.
כוכרמין מתגלה כחומר בריא ואכן זה מחושב עם סגולה רפואית שהתגלו בו לאחרונה.
מתוצאות הניסוי אנו יכולים להמליץ לאכול מזון עם צבעי מאכל צבעיים ולא מלאכותיים.
היינו ממשיכות את הניסוי עם חקירה לעומק כיצד טטרזין משפיע על גופו של אדם לטווח זמן ארוך.