פרויקט ביוטק 2016

מור אביב ויותם בירן

בחסות מכון ויצמן למדע


שמות המנחים: גדי ערמוני, ירדנה דוד ורופיידה מרווט.


שם המורה: ענת קפלן


תיכון הדרים הוד השרון

Big image

מבוא למחקר ותאורו- רקע מדעי

במהלך שהותינו במכון ויצמן למדע, ניקח חלק במחקר של האנזים PON1 ככלי לפירוק גז עצבים.

מערכת העצבים היא מערכת שתפקידה להגיב למידע הנקלט על ידי תאי חוש ואיברי חישה ולהוציא הוראות הגורמות לשרירים או לבלוטות לבצע פעולות שונות בתגובה למידע שנקלט. הגירוי שנקלט מתורגם לדחפים עצביים (חשמליים) שעוברים לאורך תאי העצב. במעבר המידע מתא עצב לתא עצב מתבצע על ידי חומרים כימיים.התא הפרי סינפטי (התא המוסר) מעביר נוירוטרנסמיטר מסויים לתא הפוסט סינפטי (התא הקולט) בהתאם לגירוי שנקלט. הנוירוטרסמיטר שנעסוק בו במכון ויצמן נקרא אצטילכולין ויש לו מספר תאי מטרה: תאי שריר ותאי בלוטה. על מנת שיתקיים איזון בין הגירוי לבין התגובה האצטילכולין חייב להיות מסולק מקולטני התא הפוסט סינפטי, והוא יסולק על ידי אנזים הנקרא אצטילכולין אסטראז.

גז עצבים הוא גז שלא ניתן לחוש את נוכחותו בעזרת התאים והוא מסוכן מאוד לאדם, הוא מהווה בלתי הפיך לאנזים אצטילכולין אסטראז, מה שגורם לאצטילכולין להמשיך ולהיות קשור לקולטני התא הפוסט סינפטי, מה שיביא לחוסר איזון בין הגירי לתגובה.

הטיפול המוכר נגד חשיפה לגז עצבים הוא הזרקת אטרופין- חומר החוסם את קולטני התא הפוסט סינפטי ובכך מצמצם את קשירת האצטילכולין מלכתחילה.

כיום, עלה צורך במציאת טיפול חלופי במקרה של חשיפה לגז עצבים היות והאטרופין גורם לנזק נוירולוגי ולא מטפל בשורש הבעיה.

במהלך ניסויים אקראיים התגלה כי תרכובות אורגנו-זרחתיות מהוות סובסטרט לאנזים PON1, כלומר PON1 מסוגל לפרק גז עצבים ללא גרימת נזק נוירולוגי היות והוא מצוי באופן טבעי בגוף האדם.

לPON1 זיקה חזקה יותר לגז עצבים על פני אצטילכולין אסטראז ולכן מונע היקשרות של גז העצבים לאצטילכולין אסטראז.

במסגרת מחקר האנזים PON1 בחרנו להתמקד ברמת ביטוי של החלבון בזן חיידקי E.coli מסויים. את התוצאות נשווה לצוות מחקר שחקר רמת ביטוי בזן חיידקי E.coli אחר. כך נוכל לקבל מידע על עדיפות כלכלית, כלומר באיזה זן חיידקים יותר משתלם להרבות את החיידקים ובהתאם לקבל PON1. מה שמוביל לשאלת המחקר שלנו:

כיצד משפיע החיידק אוריגמי על רמת הביטוי של החלבון PON1 בוריאנט W.T?

פרטיי הניסוי

המשתנה הבלתי תלוי במחקר שלנו הוא זן חיידקי אוריגאמי ממשפחת E.coli. נשתמש בזן זה החל מהניסוי המקדים בו נכניס את החיידקים, הפלסמידים הרקומביננטים ומצע הגידול במבחנת הניסוי.

המשתנה התלוי במחקר שלנו הוא רמת הביטוי של האנזים PON1 מוואריינט W.T. את רמת הביטוי נמדוד בשיטת SDS-PAGE. שם נריץ את מקטעי החלבון באלקטרופורזה בג'ל. נתמקד במקטע שהגיע בסמוך לסמן הגודל של 40K.D ונשווה את עוביו ואת צבעו למקטע החלבון של צוות המחקר השני.


הבקרה בניסוי שלנו היא בקרה פנימית השוואתית משום שבניסוי שלנו אנחנו בודקים מה הקשר בין שני המשתנים התלויים בכל ניסוי, כל מערכת מהווה מערכת ייחוס לכל אחת מהמערכות האחרות.

בניסוי שלנו ספציפית, נבדוק את רמת הביטוי שלנו לעומת רמת הביטוי של צוות המחקר השני על מנת לדעת כדאיות כלכלית.

הניסוי המקדים (מכין)

מטרת הניסוי המקדים היא ליצור חיידקים המכילים את הגן לPON1 בשיטה של הנדסה גנטית.

טרנספורמציה


בשלב זה נחדיר את הפלסמיד הרקומביננטי המכיל את הגן לPON1 אל חיידקי האוריגאמי על מנת שיבטאו את הגן.

נכין 2 מבחנות: הראשונה תהיה מבחנת ניסוי אשר תכיל חיידקי אוריגאמי, פלסמידים רקומביננטים, מצע גידול נוזלי LB ויוני סידן.

המבחנה השנייה תכיל את אותם מרכיבים פרט לפלסמידים הרקומביננטים, והיא תהווה את מבחנת הבקרה.

תפקיד יוני הסידן הוא לספק מטען חיובי דו ערכי על מנת לגשר בין הפלסמיד הרקומביננטי לבין תא החיידק.

בנוסף לכך נבצע שוק תרמי (קרח,42c,קרח,37c) שייעל את החדרת הפלסמידים לתאי החיידקים.

הפלסמיד הרקומביננטי בו נשתמש מכיל חמישה מקטעי DNA (אתרים):

1)Ori- מקטע בפלסמיד שאחראי על שיכפול לעותקים רבים בחיידק ועל פעילות הפלסמיד.

2)הגן לעמידות לאמפיצילין- לגן זה שני תפקידים: אחד הוא לברור בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד לבין אלו שלא קלטו. תפקיד נוסף הוא ליצור סביבה סטרילית מחיידקים שלא קלטו את הפלסמיד (מזהמים).

3)הגן ל-8 היסטידינים- גן המקודד לייצור של 8 ח. אמינו היסטידין שיש להן זיקה חזקה לבידי הניקל בשלב ניקוי החלבון. בזכות מספר רב זה היסטידינים, בניגוד חלבונים אחרים PON1 ינצח את האימידוזול שבבופר השטיפה על הקישור לבידי הניקל ובכך יפריד את PON1 משאר החלבונים.

4+5) אופרון הלקטוז המהונדס מכיל גם את הגן המקודד לייצור PON1 על מנת שהחיידק ייצר לנו PON1 תחת בקרת אופרון הלקטוז המהונדס, הוספנו לפלסמיד הרקומביננטי I, P ,O. מיד אחריהם הוספנו לפלסמידים את הגן המקודד לPON1. כך, בהוספת IPTG, הIPTG ייקשר לרפרסור והRNA פולימראז יוכל להיקשר לאתר המקדים ולהתחיל בתעתוק הגנים הרצויים.

זריעה וברירה של החיידקים הטרנסגנים

בשלב זה של הניסוי נשתמש ב3 צלחות פטרי:

1. צלחת המכילה אגר ואמפיצילין שעליה נזרעו חיידקים ממבחנת הניסוי. המטרה היא לברור בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד לאלו שלא מכיוון שעל הפלסמיד קיים גן נוסף שמקנה עמידות לאמפיצילין.

2. צלחת המכילה אגר ואמפצילין שעליה נזרעו חיידקים ממבחנת הבקרה. המטרה היא לבדוק שלחיידקים אין עמידות טבעית לאמפיצילין.

3. צלחת המכילה אגר עם חיידקים ממבחנת הניסוי. המטרה היא לבדוק שאין שום גורם במהלך הניסוי שגרם למות החיידקים מלבד האמפיצילין.

תוצאות הניסוי המקדים

Big image

דיון בתוצאות

בתמונה המתארת את התוצאות של הניסוי המקדים: טרנספורמציה וזריעה וברירה, ניתן לראות כי התוצאות שהתקבלו על פני צלחות הפטרי הנן הגיוניות ותואמות את השערותינו.


בצלחת הראשונה שהכילה אגר+אמפיצילין, זרענו חיידקים ממבחנת הניסוי והם יצרו 8 מושבות. כלומר מושבות אלו נוצרו על ידי חיידקים שצלחו את שלב הטרנספורמציה (קלטו את הפלסמיד המכיל את הגן לעמידות לאמפיצילין). עם החיידקים הללו נרצה להמשיך את הניסוי


בצלחת השנייה שהכילה אגר+אמפצילין זרענו חיידקים ממבחנת הבקרה. לא נוצרו מושבות, מה שמאשש את השערתנו כי לחיידקים אין עמידות טבעית לאמפיצילין.


בצלחת השלישית שהכילה אגר בלבד, זרענו חיידקים ממבחנת הניסוי. נוצר מרבד של מושבות מה שמאשר שאף גורם לא גרם למוות החיידקים פרט לאמפיצילין.


ביקורתיות: בניסוי שביצענו שכחנו להוסיף מצע גידול נוזלי LB לחיידקים בשלב של השוק התרמי. בין קירור המבחנה בקרח לבין הטבלתה באמבט מים בטמפרטורה אופטימלית של 37C. מכיוון שמצע הגידול הנוזלי מהווה את רוב נפח התמיסה, קיבלנו תמיסה בעלת נפח קטן בהרבה מהרצוי.

השפעה נוספת של היעדר מצע גידול נוזלי LB היא מחסור בחומרי מזון הכרחיים להתרבות החיידקים. ייתכן כי אילו היינו מוסיפים את המצע, היינו מקבלים מספר מושבות גבוה מ-8.

מהלך המחקר (שיטות העבודה)

גידול החיידקים הטרנסגנים (חיידקי אורגמי) עד לאמצע השלב הלוגריתמי על מנת לקבל חיידקים אנרגטיים מצד אחד וכמות גדולה של חיידקים מצד שני.


המטרה של שיטה זו היא לקבל כמות גדולה של חיידקים טרנסגנים (חיידקי אוריגמי) שיבטאו את הגן לPON1 מוריאנט W.T.

בשיטה זו לוקחים דגימה של חיידקים טרנסגנים מצלחת הניסוי המקדים. מכניסים לארנלמאייר המכיל מצע גידול נוזלי (LB). למצע הגידול מוסיפים אמפיצילין מכיוון שלא רוצים שחיידקים לא רצויים מהסביבה החיצונית יזהמו את מערכת הגידול (סביבה לא סטרילית).

את החיידקים מרבים עד לאמצע השלב הלוגריתמי מכיוון שמצד אחד הם יתרבו בכמות מספקת ומצד שני הם יהיו מספיק אנרגטיים לייצור PON1 בהמשך.


מוסיפים למצע הגידול גם יוני סידן כדי שישתמשו בהם ליצור PON1.

מטלטלים את בקבוקי הארלנמאייר במטרה להגדיל את שטח הפנים לחדירת חמצן.

לוקחים דגימת חיידקים ובודקים את רמת הבליעה בספקטרופוטומטר באורך גל של 600nm . כאשר רמת הבליעה מגיעה ל 0.6-0.8OD מפסיקים את גידולם.

ניצור מבחנת בקרה (בלאנק) המכילה את מצע הגידול הנוזלי LB ללא החיידקים לשם קריאה של רמת בליעת האור של מצע גידול LB כדי שבהמשך הספקטרופוטומטר יחסיר אוטומטית רמת בליעה זו מקיווטת הניסוי ונוכל לדעת את רמת הבליעה של החיידקים בלבד.

הוספת IPTG

אופרון הלקטוז הוא מקטע DNA המצוי בתא החיידק ותפקידו לנצל לקטוז לשם הפקת אנרגייה בתהליך הנשימה התאית. יצרנו אופרון לקטוז מהונדס על הפלסמיד הרקומביננטי כך שהחיידק ייצר עבורנו PON1 תחת בקרת אופרון הלקטוז.

על מנת שהגן לייצור PON1 יתבטא עלינו להוסיף לתמיסה IPTG שייקשר לדכאן כדי למנוע ממנו להיקשר לאתר המפעיל של האופרון ובכך לאפשר לו לתעתק את הגן המקודד לPON1 ולהבטיח ייצור של החלבון PON1.

כדי לגרום לחיידקים לייצר עבורנו את האנזים PON1, לפני הגן לPON1 נחדיר את קטעי הDNA הבאים על גבי הפלסמיד: I,P,O (האתר המווסת, האתר המקדם והאתר המפעיל).

במקום הלקטוז נשתמש במשרן אחר שנקרא IPTG.

לIPTG יש שני יתרונות על פני הלקטוז:


  • 1) הוא לא מפורק על ידי החיידק לשם יצירת אנרגיה ולכן לא אוזל.
  • 2) כניסתו אל התא אינה תלויה בנשא.

השקעת תאי החיידקים באמצעות סרכוז

צנטריפוגה הנו מכשיר המפריד חומרים על פי צפיפותם, כלומר ככל שחומר בעל צפיפות גבוהה יותר, הוא כבד יותר ולכן שוקע בתחתית המבחנה. נעשה שימוש בצנטריפוגה על מנת להפריד את תאי החיידקים (בעלי צפיפות גבוהה יותר) ממצע הגידול וכך נוכל להמשיך עם המקטע התחתון בלבד.

פיצוץ תאי החיידקים

נפוצץ את תאי החיידקים על מנת להמשיך עם החלבון PON1 שהם יצרו. נעשה זאת באמצעות תמיסת פיצוץ: Bug Buster המורכבת מ-4 מרכיבים:

1. ליזוזים- אנזים המפרק את דופן תא החיידק.

2. דטרגנט- מפרק את המרכיב הפוספוליפידי (שומני) של קרום התא.

3. נוקליאזות- אנזימים שמפרקים DNA ו-RNA על מנת לקבל תמיסה צלולה ולא צמיגה (Benzonase, DNAsei).

4. PIC- קוקטייל של מעכבי פרוטיאזות- בתא החיידק ישנם אנזימים המפרקים חלבונים (פרוטיאזות). בכדי שאנזימים אלו לא יפרקו את PON1 נוסיף מעכבים לפרוטיאזות.

סרכוז נוסף בצנטריפוגה

נסרכז פעם נוספת במטרה להפריד בין שברי הקרומים לבין החלבונים שהחיידקים סרכזו. נמשי עם הנוזל העליון (ליזט).

ניקוי החלבון בעזרת קולונת הניקל (קולונת זיקה)

המטרה היא להפריד בין החלבון PON1 לבין שאר החלבונים שסינטזו החיידקים ומצויים כולם בליזט.

ההפרדה בין PON1 לשאר החלבונים מתבצעת באמצעות איחוי של החלבון הרצוי עוד בשלב הניסוי המקדים עם הגן המקודד ליצירת פפטיד הכולל רצף של 8 היסטדינים. תוספת זו של הסטדינים מאפשרת קישור ספציפי של החלבון הרצוי לבידים של ניקל בשל זיקה גבוהה.

נשפוך את הליזט לתוך קולונה המכילה בידים של ניקל. על מנת להיפטר משאר החלבונים נוסיף בופר שטיפה המכיל אימידאזול בריכוז נמוך (20mM). אימידאזול מתחרה עם ההיסטידין על הקשירה לבידי הניקל. חלבונים המכילים מספר נמוך של היסטדינים ישטפו החוצה, לעומתם PON1 המכיל 8 היסטדינים לא ישטף החוצה וימשיך להיות קשור לבידי הניקל.

לאחר מכן נשפוך אל תוך הקולונה בופר מיצוי בעל ריכוז אימידאזול גבוהה מאוד (500mM). העלאת לערכים גבוהים מאוד גורמת לקישור האמידאזול לבידי הניקל תוך הדחת שייר ההיסטדין (להדחת חלבון המטרה) חזרה למבחנת התמיסה.

בדיקת ריכוז החלבון בשיטה ספקטרופוטומטרית

מטרת שיטה זו היא קביעת ריכוז החלבון אותו מיצינו בעזרת בופר המיצוי בשלב ניקוי החלבון. נעשה זאת בעזרת מכשיר המודד את רמת בליעת האור- ספקטרופוטומטר. PON1 הוא חלבון חסר צבע ולכן חייבים להוסיף לו צבע על מנת שיוכל להיקרא על ידי הספקטרופוטומטר. לשם הוספת הצבע נוסיף ריאגנט ברדפורד לתמיסה הנבדקת, שיטה המבוססת על היקשרות הצבע coomaise brilliant blue לחלבון. בעקבות הוספת הריאגנט, הצבע ישתנה לכחול עז (רמת בליעה של 595 ננומטר), וככל שריכוז החלבון יהיה גבוה יותר כך גם יהיה הצבע הכחול של התמיסה כהה יותר (רמת בליעה גבוהה יותר).

ניקח דגימה מן המבחנה לאחר מיצוי החלבון. ניצור שתי קיווטות: אחת קיווטה המכילה תמיסת חלבון ,ריאגנט ברדפורד ומים מזוקקים, השנייה תהיה קיווטת בקרה שתכיל מים מזוקקים וריאגנט ברדפורד בלבד (מבחנת הבלאנק).

תחילה נכניס את את מבחנת הבלאנק לספקטרופוטומטר כך שהמכשיר יבדוק את רמת הבליעה של שאר המרכיבים פרט לחלבון. בהמשך הניסוי המכשיר יחסיר את רמת הבליעה שלהם בצורה אוטומטית ונוכל לדעת את רמת הבליעה של החלבון בלבד.

נתונה לנו מראש עקומת כיול ברדפורד אשר הנוסחה שלה היא : y=0.3264x כאשר y הוא ערך ה-O.D (רמת הבליעה) ו-x הוא ריכוז החלבון במיליגרם/מיליליטר.

לאחר שבדקנו את רמת הבליעה של החלבון, נציב אותה בערך ה-y ונחלץ את ערך ה-x הלוא הוא ריכוז החלבון.

אלקטרופורזה בג'ל (הרצת החלבונים)

אלקטרופורזה בג'ל היא שיטה להפרדת חומרים הנמצאים בתערובת. מניחים את התערובת על גבי משטח העשוי ג'ל, נעביר זרם זרם חשמלי דרך הג'ל כך שצד אחד של המשטח טעון שלילית (קטודה) וצד שני טעון חיובית (אנודה). המולקולות טעונות חשמלית נעות באיטיות לעבר קצהו האחד של הג'ל בהתאם למטען החשמלי המנוגד להן.

מהירות התנועה של המולקולות תלויה במסתן המולרית כך שמולקולות כבדות יותר ינועו לאט יותר וינדדו פחות רחוק ולעומתן, מולקולות קלות יותר ינועו מהר יותר ובעקבות כך רחוק יותר.

בצד אחד נריץ סמני גודל (markers) שגודלם ידוע מראש שנשווה אותם למולוקולות הנבדקות וכך נגלה את גודל המולקולות הנבדקות.

לפני הרצת תמיסת הניסוי בג'ל נוסיף לה דטרגנט הנקרא SDS וגם מרקפתואתנול. SDS מקנה למולקולות הנודדות ציפוי שלילי ובכך מבטיח תנועה חד כיוונית: אל האנודה. שימוש נוסף להוספת SDS הוא שבירת קשרי מימן בחלבון ושימוש במרקפתואתנול גורם לשבירת קשרי S-S. שניהם גורמים להרס המבנה השלישוני והשניוני שלו ובכך כל החלבונים בתערובת הופכים ללניאריים (קוויים). החלבונים הינם חסרי צבע ולכן יש להוסיף לתמיסה תרכובת צבע הנקראת כחול קומאסי על מנת שנוכל לראות את החלבון ויזואלית.

לאחר ההרצה בג'ל נסתכל על פס הPON1 שיימצא בסמוך לפס של סמן הגודל שגודלו (מסה מולרית) 40KD.

ככל שהפס יהיה עבה יותר, וככל שצבעו יהיה כחול כהה יותר כך נדע כי רמת הביטוי של PON1 גדולה יותר.

תוצאות המחקר

1. תוצאות של חישוב ריכוז החלבון באמצעות שיטה ספקטרופוטומטרית עם ריאגנט ברדפורד

לאחר שמיצינו את החלבון הרצוי PON1 באמצעות קולונת הניקל קיבלנו חמש מבחנות אילוציה (Eׂ). אנו מצפים שבמבחנת האילוציה מס' 2 יתקבל הריכוז הגבוה ביותר של החלבון משום שבמבחנה הראשונה יתקבל בעיקר בופר ופחות חלבון מכיוון שתהליך המיצוי מהבידים לוקח זמן מה. לפנינו עומדות חמש מבחנות אילוציה שאת התמיסה שבתוכן נעביר ל-5 קיווטות שונות שאותן נכניס לבדיקה בספקטרופוטומטר. לאחר הבדיקה קיבלנו עבור כל תמיסה (E1-E5ׁׂ) רמת בליעה, ובעזרת עקומת הכיול שניתנה לנו מראש הצבנו במקום ערך ה-y את רמת הבליעה וחילצנו את ערך ה-x הלוא הוא ריכוז החלבון. כעת ידועים לנו 5 הריכוזים של כל מבחנה.

המשוואה של עקומת הכיול הנתונה לנו הינה: y=0.3264x.

להלן דוגמה של חישוב ריכוז החלבון במבחנה E2:


רמת בליעת אור שנבדקה: 0.397 O.D.


החישוב: 0.397=0.3264X

X= 1.216


בנוסף לחישוב ריכוז החלבון, חישבנו גם את כמות החלבון, כך נקבל מדד יותר מוחשי וברור לחלבון המיוצר:


כמות החלבון= ריכוז החלבון x נפח התמיסה הנתונה

cXv= n


החישוב: n=1.216 X 0.5

n=0.608

תוצאות ההרצה ב-SDS PAGE

Big image

תיאור התוצאות

ניתן לראות בתמונה את ההרצה של מקטעי החלבון הרצויים שמיצינו באלקטרופורזה בג'ל.

בבארית הימנית ביותר מצויים המרקרס (סמני הגודל) בKD.

במקביל לסמן הגודל שגודלו 40KD יימצאו מקטעי החלבון של PON1. מחד גיסא ניתן לראות את שלוש הבאריות הימניות של PON1 השייכות לקבוצה (הדר ואדיר) שחוקרת PON1 שסונתז בחיידקי E.coli מזן BL21. ומאידך גיסא ניתן לראות את שלוש הבאריות השמאליות שמורצים בהם מקטעי החלבון שהופק על ידינו (יותם ומור) מחיידקי E.coli מזן אוריגאמי.

כפי שציינו שש הבאריות מחולקות ל-2: 3 השמאליות, של החלבון שלנו ואילו 3 הימניות של קבוצת המחקר שאליה נשווה את תוצאות ההרצה. בכל קבוצה חילקנו את ההרצה ל-3 מכיוון שכך נוכל לראות את התוצאות בצורה יותר ברורה ולבדוק שהתוצאות חלות ותקפות גם בריכוזים שונים. בבארית השמאלית של כל שלישייה הורץ מקטע החלבון כמו שהוא, בבארית האמצעית הורץ מקטע החלבון מהול פי 4, ואילו בבארית הימנית הורץ החלבון מהול פי 20.

על פי התמונה שהתקבלה, אפשר לראות שבכל המיהולים מקטע החלבון של הקבוצה שלנו היה דומיננטי יותר מבחינת עובי הפס וכהותו.

דיון בתוצאות

בעקבות התוצאות שהתקבלנה בהרצה ב- SDS- PAGE נוכחנו לדעת כי רמת הביטוי של החלבון PON1 בחיידקי E.coli מזן אוריגאמי גבוהה יותר מרמת הביטוי של החלבון בחיידקי E.coli מזן BL21.

ידוע כי השימוש בזן אוריגאמי יקר יותר מהשימוש בזן BL21 אך על פי תוצאות הניסוי שלנו עלה כי זן אוריגאמי מתבטא בצורה טובה יותר וכתוצאה מכך נוצר יותר PON1. לכן השימוש בו עדיף מבחינה כלכלית.

הרקע המדעי לביטוי שהתקבל מסתמך על הנדסה גנטית. בעוד שהזן BL21 הוא הזן הטבעי של E.COLI, בזן אוריגאמי הושתקו שני גנים המעורבים ביצירת סביבה מחזרת וכתוצאה מכך קשרי הS-S בין שיירי חומצות האמינו ציסטאין היוצרים את המבנה השלישוני של החלבון לא מתפרקים והמבנה המרחבי פחות פרוש. בBL21 בניגוד לכך, המוטציה לא קיימת ולכן לא נוצרת סביבה מחזרת וקשרי הS-S מתפרקים באופן טבעי וגורמים ליצירת חלבון בעל מבנה מרחבי פרוש יותר.


כיווני המשך

לעתיד נמליץ לחזור על הניסוי עם סוג חיידק שונה במקום E.COLI שהעלות הכלכלית שלו זולה יותר וזמן הדור שלו קצר יותר ולבדוק אם יש שינוי ברמת הביטוי ורמת הפעילות של החלבון PON1 , כלומר לבדוק כמה PON1 נוצר ואת היעילות שלו בפירוק גז עצבים.



הצעות לשיפור

על מנת ליצור תוצאות אמינות יותר לניסוי היינו רוצים לערוך עוד מס' חזרות עליו. לא היה ביכולתנו לערוך חזרות מפאת זמן מוגבל ומשאבים.

בנוסף לכך, בשלב הניסוי המקדים היינו רוצים לקבל הצגה ברורה יותר. שכחנו להוסיף LB למבחנות הנבדקות ועל כן קיבלנו כמות מעטה של תמיסה.

למעט זאת היה מוטב מצידנו למרוח את תרבית החיידקים על צלחת הפטרי בעזרת מקל המריחה בצורה יסודית יותר.

ביבליוגרפיה

נספחים