עבודת ביוטק

השפעת תנאים שונים על ביטוי ופעילות האנזים PON1

נושא עבודה:השפעת ריכוזים שונים של PON1 מהווריאנט H115W בחיידקי E. coli על פעילות האנזים.

מגישים: דן גרשון, ניר אבטא וג'ואי פאור

מנחה: ד"ר שמואל כהן

בית-ספר: אמי"ת מדעי טכנולוגי כפר בתיה רעננה

מקום המחקר: מכון דוידסון- מכון ויצמן

שנה: 2015-2016

תיאור מכון חקר


מכון ויצמן למדע ברחובות. מכון ויצמן למדע הוא אחד ממכוני המחקר הרב-תחומיים המובילים בעולם.

שורשיו של מכון ויצמן יונקים ממכון המחקר על שם דניאל זיו שהוקם בשנת 1934 בתרומתם של ישראל ורבקה זיו, מלונדון, שביקשו להנציח בדרך זו את זכרו של בנם דניאל. יוזם הקמתו של מכון זיו, הרוח החיה בפעילתו המדעית ונשיאו הראשון היה ד"ר חיים ויצמן, כימאי בעל שם עולמי שעמד במשך שנים רבות בראש התנועה הציונית ולימים היה לנשיאה הראשון של מדינת ישראל. בנובמבר 1944, בהסכמתה ובברכתה של משפחת זיו, הוחלט כי מכון זיו יעמוד בבסיסו של ארגון מדעי רחב היקף שייקרא על שמו של ד"ר חיים ויצמן. בשניים בנובמבר 1949, לכבוד יום הולדתו ה- 75 של חיים ויצמן, נחנך מכון ויצמן למדע.

המכון מחולק לחמש פקולטות: מתמטיקה ומדעי המחשב, פיסיקה, כימיה, ביוכימיה ופיסיקה. הפקולטות נחלקות ל-17 מחלקות מדעיות. לאלה נוספים מדרשת פיינברג, שהיא הגוף האוניברסיטאי של המכון, המכשיר תלמידי מחקר לתארים מתקדמים בלבד.

בנוסף קיים מכון להוראת המדעים -מכון דוידסון – אשר במסגרתה בצענו את הביוטק. מכון זה מפעיל תוכניות רבות המכוונות לתלמידים, למורים ולציבור הרחב, במטרה לחלוק עם הציבור את החוויה המדעית, ולהקנות כלים להבנה של התפתחויות מדעיות וטכנולוגיות.

יעד חשוב של מכון ויצמן הוא העברה של ממצאים מחקריים וידע אקדמי שמצטבר על ידי מדעני המכון ליישומים מעשיים לשיפור הבריאות ורמת החיים. לצד המכון הוקם חברת "ידע", העוסקת בקידום יישומים תעשייתיים על בסיס המצאותיהם של מדעני המכון הוקמה בשנת 1959. מאז הייתה מעורבת ברישום של כ-1,400 משפחות פטנטים. מאז שנת 1973 חתמה "ידע" על 169 הסכמים עם חברות ישראליות לניצול הפטנטים השונים, והקימה 42 חברות (21 מתוכן הוקמו משנת 2000 ואילך). ניתן לקבל תמונה על חשיבות פיתוחי מדעני המכון מהדוגמאות הבאות:

· בדיקת מי שפיר המשמשת לבדיקת מאפיינים גנטיים של עוברים.

· כרומטוגרפית זיקה - שיטה להפרדת חומרים ביולוגיים, המשמשת כלי מרכזי בתעשיית הביוטכנולוגיה.

· מבנה ריבוזום- גילוי מבנה הריבוזום, בית חרושת לחלבונים של התא, המחקר והבנת עקרונות פעילותו, זיכו את פרופ' עדה יונת, מהמכון, בפרס נובל לכימיה. מחקר זה עשוי לאפשר פיתוח תרופות אנטיביוטיות שיהיו יעילות גם נגד חיידקים שפיתחו עמידות לתרופות קיימות.

· תרופות - מספר תרופות שפותחו במכון נמצאות בשימוש בארצות ברחבי העולם; בהן תרופת הקופקסון, המיוצרת על ידי חברת "טבע", פותחה בידי צוות חוקרים במכון ויצמן, ונחשבת לאחת הטובות ביותר המצויות כנגד מחלת הטרשת הנפוצה; ארביטוקס - תרופה אנטי סרטנית המיועדת לטיפול בסרטן גרורתי של המעי הגס ובסרטן ראש צוואר. הם המציאו את התרופה "רביף", המיוצרת ומשווקת על ידי חברת "סרונו"; ותרכיב חיסון חדש לדלקת כבד נגיפית (הפטיטיס B), שיוצר ושווק על ידי "ביוטכנולוגיה כללית".

· השתלת לשד העצם - שיטה מקורית להשתלת לשד עצם מתורם לא תואם, מיושמת במספר בתי חולים בארץ ובעולם, וכך גם שיטה מתקדמת, ולא חודרנית, להבחנה בין גידולים סרטניים לבין גידולים שפירים באמצעות תהודה מגנטית.

חקלאות- מדעני המכון פיתחו זנים שונים של גידולים חקלאיים משופרים: חיטה עשירה בחלבון ועתירת יבולים, מלונים שמקדימים להבשיל, מלפפוני דלילה עמידים כנגד מחלות.
Big image

מאמר מקדים


ביטוי ואפיון של האנזיםPON1 ככלי ביוטכנולוגי לפירוק גז עצבים (מאמר מאוחד)

Harel,M.,Aharoni, A.,Gaidukov, L., Brumshtein, B., Khersonsky,O.,Meged,R., Dvir, H., Ravelli, R.B.G., Mccarty, A., Toker, L., Silman,L., Sussman, J. 2004. Structure and evolution of the serum paraoxonase family of detoxifying and anti- atherosclerotic enzymes. Nat. Strut.Mol.Biol. 11, 412-419.

Rochu,D.,Chabriere,E.,Masson,P.,2007.Human paraoxonase: A promising approach for pre-treatment and therapy of organophosphorus poisoning. Toxicology. 233, 47-59.

תקציר

היעילות המוגבלת של אמצעים שונים כנגד הרעלה על ידי תרכובות אורגנו זרחתיות (גזי עצבים, קוטלי חרקים) מצדיקה את המאמצים שנעשים כדי למצוא למצוא שיטות חדשות לנטרול הרעלים ביניהם שימוש במולקולות כימיות וביולוגיות. מתן כמויות זעירות של אנזימים השייכים למשפחת הפאראוקסונאזות PON)), מאפשר הגנה מהירה ויעילה כנגד הרעלות. אנזימים אלו בעלי יכולת לפרק תרכובות אורגנו זרחתיות וניתן למצוא אותם בבעלי חוליות ובחסרי חוליות. מבין משפחת ה-PON ביונקים (מונה שלושה אנזימים PON1, PON2 ו-PON3)- PON1 האנושי הפך למועמד המבטיח ביותר להיות ה"מטאטא הביולוגי"- האנזים המזרז פרוק של רעלי עצבים. בנוסף, PON1 הוא אנזים בעל מגוון של פעילויות הידרוליטיות חשובות, בהן: לקטונאז (פרוק לקטון) ופעילות הקשורה במניעת טרשת עורקים, בעקבות היקשרותו לחלקיקי HDL (High Density Lipoproteins). פעילותו הטבעית של PON1 האנושי מהווה עדיין חידה לחוקרים. אחד האתגרים העיקריים בחקר PON1 האנושי, בתנאי מעבדה, הינו חוסר יציבותו ונטייתו ליצור חלקיקים לא מסיסים חסרי פעילות (אגרגטים). המאמצים המשותפים לאפיין PON1רקומביננטי שבוטא בחיידקי E. coli ו- PON1 אנושי טבעי מספקים מידע ליצירת מוטנטים יציבים של PON1 שישמשו כ"מטאטאים ביולוגיים" יעילים של גזי עצבים.

מבוא

הצד האפל של הקידמה האנושית הוא יכולתו של האדם לתכנן ולשכלל שיטות הרג. במהלך המאה ה- 20 חלה האצה בפיתוחם של כלי נשק כימיים וביולוגיים וגם בפיתוח נשק גרעיני. מלחמת עירק- איראן (1983-1988), למשל, המחישה את גודל הסכנות הכרוכות בשימוש בנשק כימי - ביולוגי. כמו כן מלחמת המפרץ (1991) עוררה חשש שעירק תתקוף את ישראל בגזי עצבים. ב- 2013 השתמש הנשיא אסד בגז העצבים סרין נגד המורדים בסוריה במהלך מלחמת אזרחים שנמשכת כבר כ- 3 שנים. החשש מפני הרעלה עקב חשיפה לרעלים אורגנו זרחתיים, בין אם עקב פעילות צבאית, פעילות טרור או פעילות חקלאית ומיצוי הפוטנציאל הקיים באמצעים הרפואיים הנוכחים יצרו את הצורך לפתח אסטרטגיות חלופיות להגנה מפני חשיפה לגזי עצבים. זה כמה עשורים נעשים ניסיונות לפתח חומרים שינטרלו את פעולתם הקטלנית של גזי העצבים. ב-2007 הכריז משרד ההגנה של ארצות הברית על פריצת דרך בפיתוח אמצעי הגנה מפני גז עצבים, שבוצע על ידי חברה ביוטכנולוגית אמריקאית ושמתמחה בהפקת חלבונים מחלב עיזים מהונדס גנטית היכולים להקשר לתרכובות אורגנו זרחתיות. החיסרון העיקרי של גישה זו שבמקרה של הרעלה צריכים להזריק למערכת הדם כמות גדולה מאוד של חלבונים שגורם לתופעות לוואי חמורות ולכן קיים צורך בגישות נוספות שיאפשרו שימוש בכמות מינימאלית להזרקה של חומר ביולוגי/כימי לגוף האדם.

גזי העצבים שייכים לתרכובות אורגנו-זרחתיות שהתגלו לראשונה ב-1937. בתקופה זו פיתחו הגרמנים שלושה חומרים רעילים השייכים לקבוצה זו (טבון, סרין, סומן). תסמיני ההרעלה משאיפת גז העצבים מסוג זה כוללים: הפרשת רוק מוגברת, התכווצות אישונים, פירכוסים ועוויתות ולבסוף מוות בחנק. המוות נגרם עקב סתימת קנה הנשימה בהפרשות או עקב הפסקת חילופי גזים בריאות כתוצאה מאי הפעלת שרירי הנשימה (הסרעפת והשרירים הבין-צלעתיים) בשל שיתוק מערכת העצבים האוטונומית.

מערכת העצבים

מערכת העצבים מורכבת מביליוני תאי עצב (נוירונים) הקולטים גירויים מהסביבה החיצונית או הפנימית ומעבירים אותם הלאה. תאי העצב הם תאים מוארכים ומסוגלים להעביר אות חשמלי לאורכם. קצה תא העצב הוא אזור דמוי פקעת המכיל נוסף לאברוני התא המופיעים גם בתאים אחרים, מעין שלפוחיות המכילות חומרים הקרויים שליחים עצביים (נוירוטרנסמיטרים). גירוי מהסביבה הופך בתא העצב לאות חשמלי העובר לאורך התא. כאשר האות מגיע לקצה התא הוא גורם לפיצוץ השלפוחיות המצויות המכילות שליח עצבי- (נוירוטרנסמיטר) שמופרש בדיפוזיה אל המרווח הסינפטי, המרווח בין תא עצב לתא מטרה שיכול להיות תא עצב אחר, תא שריר או בלוטה.

בשלפוחיות בקצה האקסון מצוי אצטילכולין Ach)), המופרש למרווח הסינפטי בעקבות אות עצבי. על גבי תא המטרה (התא הפוסט- סינפטי) מצוי קולטן ספציפי אליו נקשר אצטילכולין. הקישור לאצטילכולין מעורר שינוי בתא המטרה. כדי שהאות העצבי יהיה ברור הוא צריך להתחיל ולהסתיים בצורה מהירה. אחת הדרכים החשובות לסיום האות הסינפטי של אצטילכולין, היא, פירוקו על ידי אנזים ספציפי, המכונה אצטילכולין-אסטראז (Ach-E). זהו אחד האנזימים המהירים ביותר הפועלים בגופנו. הוא מפרק אצטילכולין לשני מרכיבים (כולין ואצטט), הנספגים מחדש לקצה העצב ששחרר אותו. עם פרוק האצטילכולין מסתיימת למעשה פעולתו ותא המטרה מוכן להגיב לגירוי הבא. לצורך פעילות תקינה של מערכת העצבים והגוף כולו צריך להיות וויסות קפדני ומדוייק של רמות האצטילכולין בסינפסה.

אצטילכולין מופרש לסינפסות בין תאי עצב במוח, לסינפסות בין תאי עצב לבין תאי שריר שלד, לסינפסות בין תאי עצב לבין תאי שריר הלב ולסינפסות בין תאי עצב לבין בלוטות. כתוצאה מכך, הוא גורם להתכווצות שרירי השלד ומעכב התכווצות של שריר הלב. במוח הוא קשור לתהליכי למידה וזיכרון. במחלת האלצהיימר, למשל, נפגעים תאי העצב במוח המייצרים אצטילכולין וכתוצאה מכך מאבד האדם את זיכרונו.

גזי עצבים פוגעים במערכות גוף רבות אבל המשותף לכולם הוא פגיעה בהולכה העצבית בין תא עצב לתא עצב ובין תאי עצב לתאי הגוף האחרים כך שתפקודם נפגע. גז העצבים הוא מעכב בלתי-הפיך.

ישנם גזי עצבים הגורמים לעיכוב פעולת האנזים אצטילכולין אסטראז. עיכוב האנזים גורם לאי פירוקו של האצטילכולין ומכאן לחסימת הקולטנים ולהפעלה מתמדת של תאי המטרה. מצב המשבש את העברת המידע וגורם לבסוף לשיתוק הסינפסות. במצב זה השרירים מתכווצים ללא הפסקה, והבלוטות מפרישות את תוצריהן ברציפות.

על פי החלטת מועצת האו"ם גזי העצבים הוכרזו כנשק להשמדה המונית שייצורו ואגירתו אסורים החל מ-1997. אך על- פי הערכות, נשק ביולוגי- כימי מפותח עדיין בכ- 20 מדינות בעולם.

Big image

אצטילכולין


גישה חדשה לטיפול בהרעלת גז עצבים באמצעות "מטאטאים ביולוגים"

הרעיון של "מטאטא ביולוגי" מבוסס על השימוש באנזימים המפרקים גזי עצבים ועל ידי כך מונעים את פעולתם, לפני שהם מגיעים ליעדם. נוכחותם של אנזימים אלו בדם, לפני החשיפה לגזי העצבים תפחית את רמתם של גזי העצבים באופן מהיר. לטיפול באמצעות אנזימים מספר יתרונות: ספיציפיות, יעילות קטליטית, היכרות עם הסביבה הפיזיולוגית והיעדר תופעות לוואי מזיקות. אנזים המשמש כ"מטאטא ביולוגי" יעיל של תרכובות אורגנו זרחתיות בתוך גוף חי (in vivo) חייב להגיב במהירות רבה עם תרכובות אילו, חייב להיות בעל זמן מחצית חיים ארוך, אסור שיעורר תגובה חיסונית וחשוב שיהיה ללא השפעות מזיקות על תהליכים ביולוגים. על מנת שאפשר יהיה להשתמש באנזים עליו להיות זמין בכמויות גדולות, עליו לפעול על מגוון גדול של תרכובות אורגנו-זרחתיות, האנזים צריך להיות יציב בתנאי טמפרטורה ואחסון שונים, מבלי לאבד מפעילותו. כמו כן, נדרשת שיטה פשוטה וידידותית להחדרת האנזים לגוף ולבסוף יש לבדוק את הכדאיות הכלכלית ביצורו התעשייתי.

ישנם כמה חלבונים/אנזימים אשר נחשבים כמועמדים ראויים לשמש כ"מטאטאים הביולוגיים" ויכולים לפרק תרכובות אורגנו-זרחתיות, ביניהם הידרולאזות שמקורם בחיידקים, מוטנטים של אצטילכולין אסטראז שמקורם באאוקריוטים ועוד. חסרונם של האנזימים ממקור חיידקי או לא הומני הוא בכך שהם עלולים לעורר תגובה חיסונית לאחר הזרקות חוזרות או להיות רעילים לגוף. ניתן להתגבר על בעיה זו באמצעות שינויים כימיים במבנה האנזים, או ניקוי מיטבי שלו. פעילותם הקטליטית של מוטנטים של אצטילכולין אסטראז, בפירוק תרכובות אורגנו- זרחתיות נמוכה מדי אך המחקר בכוון זה עדיין בחיתוליו ויש להמשיכו.

אחד הפתרונות הנחקרים לטיפול בנפגעי עצבים, גם במכון ויצמן למדע, מבוסס על פעילותו של האנזיםParaoxonase 1) PON1 ).

חלבוני PON הם משפחה של חלבונים שנמצאו ביונקים, עופות ואף בחסרי חוליות. ביונקים מצויים החלבוניםPON1 , PON2 ו – PON3ובחסרי חוליות נמצא חלבון יחיד PON אשר יכול להראות דמיון לכל אחד משלושת החלבונים של PON. האנזים PON1 מסונתז בכבד ומצוי בסרום של יונקים. הוא מזרז הידרוליזה של תרכובות אורגנו-זרחתיות, ביניהן גזי- עצבים, ובכך מנטרל את השפעתן הרעילה. מספר יתרונות לאנזים PON1 כמזרז הידרוליזה לתרכובות אורגנו זרחתיות: הוא חלבון אנושי ולכן לא תתלווה להזרקתו תגובה חיסונית לא רצויה, הפעילות הקטליטית שלו יעילה ואף ניתנת לשיפור באמצעות הנדסת חלבונים, הוא מציג יציבות תרמית ואיחסונית, זמן מחצית החיים שלו מתאים ואין לו השפעות התנהגותיות או פיזיולוגיות. חישובים מראים שמנה של 120 מ"ג של PON1 המוזרקת לאדם במשקל של 70 ק"ג יעילה בהורדת ריכוז טוקסי של גז עצבים.

למרבה הפלא, נתגלה כי האנזים PON1 הוא אנזים רב פעלים. בנוסף לפעילותו בפירוק גזי עצבים יש לו תפקיד במניעת טרשת עורקים. חלקיקי LDL (Low Density Lipoprotein) נוצרים בכבד ומתחמצנים בדרכם אל תאי הגוף, שוקעים בדפנות העורקים ומעלים את הסיכון למחלות לב וכלי דם. האנזים PON1 מפחית את כמות הליפידים המחומצנים המצויים ב-LDL (על- ידי עיכוב חימצונם). יחד עם זאת, פעילותו העיקרית של האנזים PON1 הוא זירוז הידרוליזה של לקטונים.

השם פאראוקסונאז שניתן לחלבונים אילו הוא שם הסטורי מאחר שלמשפחת חלבוני PON מגוון רחב של פעיליות פרוק. PON1 הוא היחיד במשפחה שיכול לבצע את כל הפעולות הקטליטיות הבאות: 1. לקטונאז (מפרק לקטונים) 2. אסטראז (מפרק אסטרים ואסטרים טבעתיים) 3. פוספוטריאסטראז (או פראוקסונאז: מפרק קוטלי חרקים וגזי עצבים) 4. מעכב חימצון של LDL ונקשר לחלקיקי HDL. ואילו PON2 ו – PON3 הם בעלי פעילות עיקרית של לקטונאז ללא פעילות פוספוטריאסטראז או אסטראז כלל.

בעבודה זו נחקרו המבנה והפעילות של האנזים PON1. יתכן ואנזים זה יוכל לספק בעתיד מענה לשתי בעיות שונות: חשיפה לגזי עצבים ומניעת התפתחות טרשת עורקים. בתחילה ניסו להפיק PON1 מכבד או מסרום אדם אך הכמויות שהתקבלו היו קטנות וגם החלבון שהופק יצר אגרגטים ושקע כצברים חסרי פעילות בגלל אופיו ההידרופובי. לכן, בשיטות של הנדסה גנטית שיבטו את הגן האנושי ל-PON1 בחיידקי E.coli , אך לא נוצר PON1 פעיל. החלבון שהתקבל היה עדיין בלתי מסיס ושקע. לאחרונה הצליחו להפיק PON1המתבטא בצורה מסיסה ופעילה בחיידקי E.coli ובעלי אותם מאפיינים כמו פאראוקסונזות שנוקו מסרום אדם, זאת על ידי יצירת גרסאות מהונדסות שלו. הכמות הנכבדת של האנזימים הפעילים, אפשרה באמצעות שיטות מעבדתיות שונות לספק תיאור מקיף של מאפייני PON1.

שיטות שלבי העבודה לגילוי מבנהו המרחבי של PON1 היו: שיבוטו של הגן המקודד ל- PON1 בחיידקים, ביטויו של האנזים (ייצורו), בידודו וניקויו, גיבושו לגבישים, פענוח המבנה הגבישי שלו באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני X , ניתוח המבנה התלת מימדי של מולקולות החלבון.

החוקרים נדרשו להפיק כמויות גדולות ואיכותיות של האנזים ולשם כך הם השתמשו בשיטת מחקר הקרויה "אבולוציה מכוונת".

אבולוציה מכוונת (Directed evolution)

שיטה זו, המשמשת בהנדסת חלבונים, רותמת שני עקרונות של האבולוציה הדארווניסטית: יצירה של גרסאות גנטיות רבות וברירה טבעית ביניהן. לשיטה זו שלושה שלבים:

שלושת השלבים הקיימים בניסוי Directed evolution:

1. Diversification (יצירת שונות) - השראת מוטציות נקודתיות אקראיות בגן המקודד לחלבון המטרה -PON1 ,על מנת ליצור "ספרייה" רחבה של גנים. בשיטה זו מוטציות אקראיות מוחדרות לגן המטרה. הגרסאות הרבות (re- PON1s) של הגנים הוחדרו לחיידקי E. coli.

2. Screen/selection (סריקה/ סלקציה) - הספרייה שהתקבלה נבחנת על מנת לבדוק האם קיימים מוטנטים בעלי התכונה בה אנו מעוניינים על ידי שימוש בסלקציה או סריקה. שיטת הסריקה צריכה להיות מהירה, רגישה ומהימנה על מנת לאפשר לנו לשלוט על פעילות אנזים במספר גדול של דוגמאות בדרך מהירה ויעילה.

סלקציה- שיטה זו באופן אוטומטי שוללת את כל המוטנטים חסרי התפקוד על ידי כך שמאפשרת את הגידול רק של מוטנטים המציגים את התכונה הרצויה. חשוב לציין ששלב יצירת השונות הינו לכלל הגנים, שלב הסלקציה/ סריקה ספציפי לחלבון בעל התכונה הרצויה, לכן זהו השלב חשוב ומאתגר ביותר בניסוי זה. מאחר ולפאראוקסונזות סובסטרטים ופעילויות שונות, נבדקה פעילותו של כל מוטנט על שלשה סובסטרטים שונים. נבדקת הפעילות כפוספוטריאסטראז, כלקטונאז וכאסטראז.

3. Amplification (הגברה), הגרסאות הגנטיות- המוטנטים שזוהו עד כה משוכפלים לכמויות רבות, דבר המאפשר לקבוע את רצף הדנ"א על מנת לזהות את המוטציות שגרמו לתפקוד החדש של החלבון.

שלושת השלבים הנ"ל נקראים "סיבוב" של אבולוציה ישירה. ברוב הניסויים משתמשים ביותר מסיבוב אחד, כאשר בסיבוב הבא נשתמש ב"מנצחים" של הסיבוב הקודם (הם יהוו את הבסיס ליצירת השונות). בסוף הניסוי החלבון המוטנטי מאופיין על ידי שיטות ביוכימיות.

היתרון של שיטה זו הוא שאין צורך בידע רב על מבנה או תפקוד חלבון המטרה. לכן, ניתן להשתמש בשיטה זו לצורך הנדוס חלבונים עבור חלבונים שמבנם טרם נקבע בקריסטלוגרפיה בקרני X.

ניסיונות ראשוניים לקביעת המבנה של האנזים PON1 נעשו על כמויות מוגבלות של חלבונים שנוקו מסרום של אדם. PON1 אנושי הוא בלתי יציב ונוטה ליצור אגרגטים. לכן, בניסויים של אבולוציה מכוונת ניסו החוקרים למצוא סוגים של האנזים PON1 מסיסים שיבוטאו בהצלחה בחיידקים. ואכן, ערבוב של ארבעה גנים המקודדים ל- PON1ממשפחות שונות (אדם, ארנבת, עכבר וחולדה) הצטיינו ברמות גבוהות של פעילות לגבי הסובסטרט הרצוי כך שנוצרו זנים רקומביננטיים של PON1שבוטאו בחיידקי E.coli .

שיבוט הטרנסגן של PON1 בפלסמיד של חיידקים

הדנ"א של החלבון המוטנטי "המנצח", בעל הפעילות הרצויה, מוחדר לפלסמיד בחיידקים. הפלסמידים אליהם חדר דנ"א זה של PON1 מכילים אתרי הגבלה לאנזימי הגבלה שונים, אלמנטים של בקרת אופרון הלקטוז, עמידות לאמפיצילין, איזור המקודד ל 6-8 היסטידינים (כדי לנקות בשלב מאוחר יותר את החלבון) . הפלסמידים והדנ"א המוטנטי נחתכו ע"י אותו אנזים הגבלה, ועורבבו. בעקבות אירוע ההיצמדות בין הטרנסגן לפלסמיד התקבלו פלסמידים רקומביננטים.

טרנספורמציה לחיידקים

הפלסמידים הרקומביננטים הוחדרו בטרנספורמציה לחיידק ביטוי בכדי לאפשר ביטוי בעודף של החלבון הרצוי. ישנן שיטות שונות להחדרת הפלסמיד לתוך החיידק, למשל: שימוש בטמפרטורות קיצוניות של קירור ולאחר מכן חימום, שימוש ביונים דו-ערכיים שגורמים לתנועה של הפלסמיד הטעון במטען שלילי לחיידקי ביטוי (E. coli).

ביטוי הטרנסגן של PON1 בחיידקים (תחת בקרת אופרון הלקטוז)

הטרנסגן מבוטא תחת בקרה של אופרון הלקטוז. אופרון הלקטוז מבוקר באמצעות הוספת המשרן IPTG בריכוזים שונים ובתנאים שונים (של טמפרטורה וזמן) ומאפשר לקבל ביטוי אופטימלי של האנזים. צפוי שיתקבלו וריאנטים שונים של האנזים בהתאם לסוג הטרנסגן שהוחדר לחיידק.

פיצוץ כימי של החיידקים

כאשר הביטוי יעיל רוב החלבונים בתא החיידק יהיו מסוג החלבון הרצוי PON1. להפקת החלבון מתא החיידק, יש להשתמש בתמיסה המכילה למשל את האנזים ליזוזים שמזרז את פירוק דופן תא החיידק וגם דטרגנט כלשהו המפרק את קרום תא החיידק. החלבון מופרד משאר מרכיבי התא ע"י סרכוז כאשר בסוף תהליך זה נקבל את שברי התאים כמשקע ואת החלבונים (החלבון הרצוי + חלבוני החיידק) כתרחיף (הנוזל העליון = ליזט).

ניקוי החלבון בעזרת קולונה זיקה (קולונת ניקל)

הנוזל שהתקבל לאחר פיצוץ התאים מכיל תערובת של חלבונים שבוטאו בחיידקים, ביניהם החלבון PON1.

ההפרדה של החלבון PON1 נעשית באמצעות קולונת זיקה. החלבון הרצוי עבר איחוי עם פפטיד הכולל רצף של 8 חומצות אמינו מסוג היסטידין. תוספת זו מאפשרת קישור ספציפי של החלבון לחרוזי הניקל שבקולונה בגלל הזיקה הגבוהה של הניקל לטבעת האימידזולית של היסטידין. קשירת החלבון PON1 והפרדתו משאר החלבונים ולאחר מכן הדחת החלבון מהקולונה מתבצעות באמצעות ריכוזים שונים של אימידזול חיצוני המתחרה עם החלבון PON1 על הקישור לניקל.

בדיקת רמת ביטוי החלבון על ידי אלקטרופורזה ב- SDS-PAGE

אלקטרופורזה היא שיטה המאפשרת הפרדת חומרים המצויים בתערובת על גבי ג'ל העשוי מפולימר הקרוי פוליאקרילאמיד בשדה חשמלי .

בשיטה זו לפני ההפרדה מוסיפים לתערובת החלבונים את החומר SDS (סודיום דודציל סולפט). SDS גורם לדנטורציה של החלבון ולטעינתו במטען שלילי. ההפרדה של החלבון של החלבון PON1 משאר החלבונים תהיה מבוססת על מסתם המולרית של החלבונים. ככל שמולקולות החלבון קטנות יותר, תנועתן לעבר האלקטרודה החיובית מהירה יותר, ולהיפך. כך ניתן להפריד את החלבונים על -פי הגודל, להעריך את גודלו של החלבון הרצוי על –פי השוואה לסמני גודל ידועים ולקבוע את רמת ביטוי החלבון הרצוי לפי הצבע ועובי הפס המתקבל.

בדיקת רמת פעילות אנזימטית (מכשיר אלייזה)

לבדיקת הפעילות האנזימטית של החלבון מספר מטרות:

1. בדיקת פעילות האנזים מלמדת על דרגת הניקוי של האנזים PON1 שהופק. ככל שהאנזים נקי יותר, כך גבוה יותר היחס בין פעילות האנזים לריכוז החלבון הכללי של תאי החיידק.

2. מאחר ולפאראוקסונזות סובסטרטים ופעילויות שונות, נבדקה פעילותו של כל וריאנט על שלשה סובסטרטים שונים. נבדקה הפעילות כפוספוטריאסטראז (פראוקסון), כלקטונאז (גאמא-בוטירו-טיולקטון) וכאסטראז (2-נפטיל- אצטאט).

3. כדי ללמוד על מבנה האתר הפעיל והמנגנון הקטליטי נבדקה פעילותו של הואריאנט הדומה לזן הבר, עבור שני סובסטרטים בטווח רחב של pH, ונקבעה יעילותו הקטליטית בכל pH ((Kcat/Km דהיינו היחס בין מהירות הפירוק של התצמיד ES ליעילות הקישור בין האנזים לסובסטרט.

Kcat – מספר מולקולות הסובסטרט שמשתנות לתוצר על-ידי מולקולת אנזים אחת ביחידת זמן, כשהאנזים פועל במהירות מירבית. במילים אחרות: המספר המירבי של תגובות אנזימטיות שאנזים יכול לעשות ביחידת זמן (בדרך כלל בשניה). ערך זה הוא ערך נתון וקבוע לאנזים מסוים על סובסטרט מסוים, בתנאים מוגדרים של pH וטמפרטורה.





Km – ריכוז סובסטרט המביא למחצית מהמהירות המרבית של פעילות האנזים. ערך זה הוא ערך נתון וקבוע לאנזים מסוים על סובסטרט מסוים, בתנאים מוגדרים של pH וטמפרטורה. ככל שערכו קטן יותר מהירות התגובה המקסימלית גדולה יותר.

קביעת המבנה המרחבי של האנזים PON1 - קריסטלוגרפיה בקרני X

קביעת המבנה המרחבי של האנזים נקבע על וריאנט רקומביננטי שבוטא בחיידקי E. coli.

החלבון נוקה וגובש. הגבישים גדלו במשך 3 ימים. גביש הוא הצורה האידיאלית לניתוח מבנה מרחבי בשל המבנה הייחודי של גבישי חלבונים. הקרניים עוברות עקיפה בתוך הגביש כתוצאה מהאינטראקציה שלהם עם האטומים ומשנות את כיוון תנועתן. מדידת פיזור הקרינה, שנגרם על ידי גבישי החלבון מאפשר לפענח את המבנה המרחבי של החלבון. החוקרים השתמשו בקרינה שמקורה בסינכרוטרון שהוא מאיץ חלקיקים מעגלי שחלקיקים מואצים בו באמצעות שדות חשמליים משתנים וסיבוב קרן החלקיקים מתבצע באמצעות שדות מגנטיים. האלקטרונים המואצים למהירות הקרובה למהירות האור תוך שהם פולטים קרינה באורכי גל שונים, כולל קרני X. המידע המתקבל עובר אנליזה באמצעות שיטות מתימטיות.

שאלות

1. כיצד מועבר הדחף העצבי לאורך תא העצב, וכיצד ממנו אל התא הבא?

גירוי עצבי עובר בתאי עצב. הוא מתחיל בדנדריט ומתורגם בהם לאות חשמלי וכך עובר במהירות גבוהה מאוד דרך האקסון, עד לקצה האקסון. בקצה האקסון האות החמשלי מתורגם לאות כימי ועובר בסינפסה במהירות גבוהה מאוד אך קטנה ממהירות האות החשמלי. לאחר שעובר בסינפסה האות מגיע לדנדריטים של תא העצב הבא ומשם מתורגם לאות חשמלי וכך הלאה, עד שמגיע לתא המטרה.

בסוף השרשרת של תאי העצב, משתחר חומר מהסינפסה אל תא המטרה, הנקרא אצטיל כולין. האצטיל כולין מורה על פעולה מסויימת וחשוב מאוד שיתפרק מיד לאחר פעילותו. האנזים המפרק את האצטיל כולין נקרא אצטיל כולין אסטרז.

2. א. מהו גז עצבים וכיצד פוגעים גזי העצבים בהולכה העצבית?

גז עצבים הוא נשק כימי. גז העצבים מונע את פעולת האצטיל כולין אסטרז, אשר באופן רגיל מווסת את פעילות הנוירוטרנסמיטר אצטיל כולין. גז העצבים תוקף את מערכת העצבים של האדם.
התסמינים הראשונים של חשיפה לגז עצבים הם נזלת, קושי בנשימה והתכווצות אישונים. לאחר מכן לנגע אין שליטה על יתר השרירים שלו עד למצב של מוות משיתוק. במידה והנפגע מקבל טיפול, הוא יכול להינצל.

ב. איזה סוג של מעכב מהווה גז העצבים? פרטו.

מעכב לא תחרותי, מפני שהקשר שלו הוא בלתי הפיך.

3. א. בערכות המגן מצוי מזרק אטרופין המשמש לטיפול עצמי בעת חשיפה לגז עצבים.

מהו האטרופין ומהו מנגנון השפעתו?

ב. מהם היתרונות של שימוש באנזים לטיפול בגז עצבים על פני הטיפול באטרופין?

א. אטרופין הוא תרכובת אורגנית הניתנת לזיקוק מצמחים המייצרים אותו באופן טבעי. אטרופין גורם לכך שמערכת העצבים הפראסימפתטית תצטמצם. האטרופין הוא מעכב תחרותי לאצטילכולין על אתרי הקישור בדנדריטים, בכך שהוא מצמצם את הקישור של אצטילכולין לדנדריטים הוא מצמצם בעקיפין את פעולת גז העצבים ופוגע פחות מגז העצבים במערכת העצבים ובגוף האדם.

אנזים Pon1 מפרק את גז העצבים ובכך מונע את פעילותו לגמרי לעומת האטרופין שרק מצמצם את פעילותו של גז העצבים משמעותית. בנוסף לכך, לאנזים אין תופעות לוואי לעומת האטרופין החוסם את אתרי הקישור בדנדריטים ומונע ממערכת העצבים לפעול. הPon1 נשאר לגוף לתמיד, לעומת האטרופין שיש לקחת כל פעם כשנחשפים לגז עצבים.

4. מהן התכונות הרצויות לאנזים על מנת שישמש כ"מטאטא ביולוגי" יעיל לסילוק תרכובות אורגנו- זרחתיות וימצא מתאים לשיווק מסחרי?

ספיציפיות, יעילות קטליטית, היכרות עם הסביבה הפיזיולוגית והיעדר תופעות לוואי מזיקות. אנזים המשמש כ"מטאטא ביולוגי" יעיל של תרכובות אורגנו זרחתיות בתוך גוף חי (in vivo) חייב להגיב במהירות רבה עם תרכובות אילו, חייב להיות בעל זמן מחצית חיים ארוך, אסור שיעורר תגובה חיסונית וחשוב שיהיה ללא השפעות מזיקות על תהליכים ביולוגים, על נחומר להיות יציב בתנאי טמפרטורה ואיחסון, שיטה ידידותית להחדרת האנזים לגוף וכדאיות כלכלית בייצור התעשייתי.

5. מהם האלמנטים השונים בפלסמיד שעשו בו את הטרנספורמציה? הסבר למה הם נועדו.
אחד האלמנטים בפלסמיד שעבר טרנספורמציה הוא שיש לו אתרי הגבלה רבים, כדי שיהיה אפשר לחתוך אותו בהרבה מקומות. בנוסף אזור בקרת אופרון הלקטוז על מנת לשלוט על זמן הפעלת הגן הרצוי. יש גם אזור עמידות לאנטיביוטיקה (אמפצילין) על מנת לבדוק באיזהחיידק נכנס הפלסמיד. אזור המקודד ל6 עד 8 היסטדינים כדי לנקות את החלבון מאוחר יותר.

6. בניסוי המתואר במאמר בדקו החוקרים את פירוק גז העצבים על ידי האנזים PON1 המקורי ועל ידי שני אנזימים מוטנטים: המוטנט PON1- 4E9 והמוטנט PON1- 2D8.

א. קבע על פי הנתונים בגרף איזה אנזים הוא היעיל ביותר בפירוק גז העצבים? נמק.

א. האנזים PON1-4E9 הוא האנזים היעיל ביותר בפירוק גז העצבים, מפני שהבליעה מתקבלת בהכי פחות זמן ובצורה החזקה ביותר, וזה מעיד על פעולה מהירה של האנזים

ב. מדוע לא הסתפקו החוקרים בניסוי הראשוני ובחרו לבחון את השפעת האנזימים המוטנטים גם על הישרדות עכברים?

ב. החוקרים בדקו את פעולת האנזימים גם בעכברים על מנת לבדוק האם יש השפעה של המערכות השונות בגוף על פעילות האנזים.

7. א. על פי התוצאות המוצגות בטבלה 1, איזה מוטנט יעיל בטיפול בפגעי גז עצבים? נמק.

האנזים PON1-4E9 מפני שאחוז העכברים ששרד לאחר הזמנים הנבדקים

בניסוי הוא הגדול ביותר

ב. על פי התוצאות המוצגות בטבלה 2, הצע הסבר לשוני ביעילות של פירוק גז העצבים על ידי שני האנזימים המוטנטיים של PON1 (התייחסו לערכי Km ו-Kcat של כל מוטנט).

השוני ביעילות בין שני האנזימים בא לידי ביטוי בערכי הKm ו Kcat, באנזים

PON1-4E9 ערך הKm נמוך יותר ולכן הזיקה של האנזים לסובסטרט גבוהה יותר, וערך הKcat גבוה יותר מאשר באנזים האחר מכאן שקצב פעולתו גבוה יותר.

8. א. מדוע התעורר הצורך להפיק את האנזים PON1 מתאי חיידקים ולא מסרום של אדם?

א. מפני שכמויות האנזים שהתקבלו היו קטנות מאוד, ונוצרו משקעים חסרי

פעילות עקב היותם הידרופוביים (לא מסיסים במים).

ב. באיזו בעיה נתקלו החוקרים בניסיונות ההפקה מחיידקים וכיצד היא נפתרה?

הבעיה היא שגם הpon1 שנוצר מהחיידקים היה לא פעיל והיה למשקעים לא פעילים ולא מסיסים במים. הבעיה נפתרה ע''י יצירת גרסאות מהונדסות של האנזים PON1.

מושגים

1. מבנה תא עצב: תא העצב מורכב מהדנדריט ושלוחות הדנדריט. בין תאי העצב ישנן סינפסות שתפקידן להעביר מידע בין תאי העצב. המיד עובר בסינפסות באמצעות נוירוטרנסמיטרים. גרעין התא נמצא בתוך הדנדריט.
שלוחות הדנדריט מורכבות מאקסון, המעביר את המידע שנקלט בדנדריט לתאים אחרים בערת אותות חשמליים.

2. אצטילכולין: אצטיל כולין הינו סוג של נוירוטרנסמיטר המעביר מידע בין תאי העצב. האצטיל כולין מועבר במהירות גבוהה מאוד וחשוב שזמן מחצית החיים שלו יהיה קצר מאוד על מנת לעצור את הפקודה מיד. האנזים המפרק את האצטיל כולין הוא אצטיל כולין אסטרז, ובלי האנזים המפרק, פעולת האצטיל כולין תימשך מה יגרום לשיתוק מיידי של הגוף.

3. מ-DNA לחלבון: חשוב לציין כי המידע התורשתי נמצא בגרעין התא אך לא כל המידע התורשתי יהפך לחלבון. השלב הראשון הוא הדבקת התחלים המתאימים על מנת לתחום את מקטע הDNA הרצוי. בנוסף, יתחבר pRNA, מתחבר לפרומוטר ופותח את גדילי הDNA. בשלב השני נוקליאוטידים מתחברים לשני הגדילים ומתחילים להעתיק את הDNA לmRNA. בשלב השלישי, יהיה תהליך של עיבוד הRNA בו אקסונים נשארים ואילו אינטרונים יורדים מהמקטע על מנת לא לקודד לחלבון. בשלב הרביעי מתחברים לmRNA אשר נמצאת בציטופלזמה, tRNA, כל אחד מתחבר לקודון אחד (3 נקליאוטידים רצופים) מצידו האחד והצד השני מאותת לחומצת אמינו. בשלב החמישי מגיע הריבוזום ומחבר בין כל חומצות האמינו עד לקבלת רצף ארוך של חומצות אמינו. בשלב השישי רצף הנוקליאוטידים עוברים תהליך של קיפול על מנת לתפקד כמו שצריך.

4. מוטציה: שינוי בנוקליאוטיד אחד או יותר המשבש את תפקוד התא. אפילו שינוי בנוקליאוטיד אחד יכול להיות קטלני, ומאידך גם יכול להיות בלתי מורגש, אם מדוב בהחלפה של נקיאוטיד, והקודון הרגיל והקודון שעבר מוטציה מאותתים לאוה חומצת אמינו.

5. אנזים PON1 (מאפייניו, סובסטרטים, מבנה מרחבי): PON1 הוא אנזים אשר מפרק את גז העצבים. ישנם מספר סוגים של אנזימי PON, אך האחד בו השימוש הוא היעיל ביותר הוא PON1 האנושי מכיוון שאין חשש שהגוף יפתח תגובה חיסונית נגדו. PON1 האנושי הפך למועמד המבטיח ביותר להיות ה"מטאטא הביולוגי"- האנזים המזרז פרוק של רעלי עצבים. בנוסף, PON1 הוא אנזים בעל מגוון של פעילויות הידרוליטיות חשובות, בהן: לקטונאז (פרוק לקטון) ופעילות הקשורה במניעת טרשת עורקים, בעקבות היקשרותו לחלקיקי HDL (High Density Lipoproteins). פעילותו הטבעית של PON1 האנושי מהווה עדיין חידה לחוקרים. אחד האתגרים העיקריים בחקר PON1 האנושי, בתנאי מעבדה, הינו חוסר יציבותו ונטייתו ליצור חלקיקים לא מסיסים חסרי פעילות (אגרגאטים). המאמצים המשותפים לאפיין PON1רקומביננטי שבוטא בחיידקי E. coli ו- PON1 אנושי טבעי מספקים מידע ליצירת מוטנטים יציבים של PON1 שישמשו כ"מטאטאים ביולוגיים" יעילים של גזי עצבים.

6. "שיטת האבולוציה המכוונת": שיטה זו, המשמשת בהנדסת חלבונים, רותמת שני עקרונות של האבולוציה הדארווניסטית: יצירה של גרסאות גנטיות רבות וברירה טבעית ביניהן. לשיטה זו שלושה שלבים:

שלושת השלבים הקיימים בניסוי Directed evolution:

1. Diversification (יצירת שונות) - השראת מוטציות נקודתיות אקראיות בגן המקודד לחלבון המטרה -PON1 ,על מנת ליצור "ספרייה" רחבה של גנים. בשיטה זו מוטציות אקראיות מוחדרות לגן המטרה. הגרסאות הרבות (re- PON1s) של הגנים הוחדרו לחיידקי E. coli.

2. Screen/selection (סריקה/ סלקציה) - הספרייה שהתקבלה נבחנת על מנת לבדוק האם קיימים מוטנטים בעלי התכונה בה אנו מעוניינים על ידי שימוש בסלקציה או סריקה. שיטת הסריקה צריכה להיות מהירה, רגישה ומהימנה על מנת לאפשר לנו לשלוט על פעילות אנזים במספר גדול של דוגמאות בדרך מהירה ויעילה.

סלקציה- שיטה זו באופן אוטומטי שוללת את כל המוטנטים חסרי התפקוד על ידי כך שמאפשרת את הגידול רק של מוטנטים המציגים את התכונה הרצויה. חשוב לציין ששלב יצירת השונות הינו לכלל הגנים, שלב הסלקציה/ סריקה ספציפי לחלבון בעל התכונה הרצויה, לכן זהו השלב חשוב ומאתגר ביותר בניסוי זה. מאחר ולפאראוקסונזות סובסטרטים ופעילויות שונות, נבדקה פעילותו של כל מוטנט על שלשה סובסטרטים שונים. נבדקת הפעילות כפוספוטריאסטראז, כלקטונאז וכאסטראז.

3. Amplification (הגברה), הגרסאות הגנטיות- המוטנטים שזוהו עד כה משוכפלים לכמויות רבות, דבר המאפשר לקבוע את רצף הדנ"א על מנת לזהות את המוטציות שגרמו לתפקוד החדש של החלבון.

שלושת השלבים הנ"ל נקראים "סיבוב" של אבולוציה ישירה. ברוב הניסויים משתמשים ביותר מסיבוב אחד, כאשר בסיבוב הבא נשתמש ב"מנצחים" של הסיבוב הקודם (הם יהוו את הבסיס ליצירת השונות). בסוף הניסוי החלבון המוטנטי מאופיין על ידי שיטות ביוכימיות.

היתרון של שיטה זו הוא שאין צורך בידע רב על מבנה או תפקוד חלבון המטרה. לכן, ניתן להשתמש בשיטה זו לצורך הנדוס חלבונים עבור חלבונים שמבנם טרם נקבע בקריסטלוגרפיה בקרני X.


ניסיונות ראשוניים לקביעת המבנה של האנזים PON1 נעשו על כמויות מוגבלות של חלבונים שנוקו מסרום של אדם. PON1 אנושי הוא בלתי יציב ונוטה ליצור אגרגטים. לכן, בניסויים של אבולוציה מכוונת ניסו החוקרים למצוא סוגים של האנזים PON1 מסיסים שיבוטאו בהצלחה בחיידקים. ואכן, ערבוב של ארבעה גנים המקודדים ל- PON1ממשפחות שונות (אדם, ארנבת, עכבר וחולדה) הצטיינו ברמות גבוהות של פעילות לגבי הסובסטרט הרצוי כך שנוצרו זנים רקומביננטיים של PON1שבוטאו בחיידקי E.coli .

7. פלסמיד: פלסמיד הוא מקטע DNA שאינו חלק מה-DNA הכרומוזומלי, ומתפקד כיחידה עצמאית המסוגלת להשתכפל בעצמה. הפלסמיד לרוב מופיע בחיידקים, אך יכול להופיע גם באורגניזמיםאאוקריוטיים (כדוגמת Saccharomyces cerevisiae) והוא בעל צורה מעגלית ומורכב מ-DNA דו גדילי.

8. עקומת גידול של חיידקים: עקומת הגידול של חיידקים מתארת מבחינה כמותית את מספר החיידקים המצע, החל מהכנסת החיידקים למצע ועד למותם.
שלב הסתגלות- בשלב זה אין התרבות של חיידקים. החיידקים הוכנסו למצע המזון והם נמצאים בתהליכי הסתגלות למצע החדש.
2. שלב הגידול המעריכי (הלוגריתמי) - החיידקים מתרבים בקצב מהיר. כמות החיידקים החיים בתרבית מוכפלת מדי דור. ומספר החיידקים גדל בחזקות של 2. בסיומו של שלב זה תרבית החיידקים צפופה מאוד.
3.שלב העמידה (הגידול היציב)- מספר החיידקים החיים נותר קבוע. התרבית צפופה, תחרות על מזון וחמצן (גורמים מגבילים). מס' החיידקים המתים = לקצב הריבוי.
4. שלב התמותה- בשלב זה קצב ההתרבות נמוך מקצב התמותה. ירידה במס' החיידקים החיים.

9. אופרון הלקטוז: אופרון הלקטוז הוא מערכת בקרה על גן מסוים. משתמשים באופרון הלקטוז כשרוצים לשלוט בזמן הביטוי של גן מסוים, כמו למשל הפעלת גן רק בשלב העמידה של החיידקים על מנת לרכז את האנרגיה בשלבים הקודמים לשם התרבות בלבד. מערכת בקרה זו עובדת בעזרת דכאן, ורק בסביבה עשירה בלקטוז, הדכאן משתחרר ומאפשר לתא לבטא את הגן.

10. Km- קבוע מיכאליס מנטן , Kcat- קבוע קטליטי:Km –קבוע מיכאליס מנטן , Kcat- קבוע קטליטי- כדי ללמוד על מבנה האתר הפעיל והמנגנון הקטליטי נבדקה פעילותו של הואריאנט הדומה לזן הבר, עבור שני סובסטרטים בטווח רחב של pH, ונקבעה יעילותו הקטליטית בכל pH ((Kcat/Km דהיינו היחס בין מהירות הפירוק של התצמיד ESליעילות הקישור בין האנזים לסובסטרט.

Kcat – מספר מולקולות הסובסטרט שמשתנות לתוצר על-ידי מולקולת אנזים אחת ביחידת זמן, כשהאנזים פועל במהירות מירבית. במילים אחרות: המספר המירבי של תגובות אנזימטיות שאנזים יכול לעשות ביחידת זמן (בדרך כלל בשניה). ערך זה הוא ערך נתון וקבוע לאנזים מסוים על סובסטרט מסוים, בתנאים מוגדרים של pH וטמפרטורה.

Km – ריכוז סובסטרט המביא למחצית מהמהירות המרבית של פעילות האנזים. ערך זה הוא ערך נתון וקבוע לאנזים מסוים על סובסטרט מסוים, בתנאים מוגדרים של pH וטמפרטורה. ככל שערכו קטן יותר מהירות התגובה המקסימלית גדולה יותר


כרטיס ביבליוגרפי:

שם המאמר: ביטוי ואפיון של האנזים pon1 ככלי ביוטכנולוגי לפירוק גז עצבים (מאמר מאוחד)

מחברים: Harel.M.Aharoni et al , Rochu.D.Chabriere et al

מקור: Nat.Strut.Mol.Biol. 11,412-419

Toxicology.233, 47-59

תקציר: המאמר הראשון מציג בעיה שהאמצעים כנגד הרעלה על ידי תרכובות אורגנו זרחתיות (כגון: גז עצבים) לא יעילים ומוגבלים (כגון: מזרק אטרופין). נתגלה, שמתן כמויות זעירות של אנזימים השייכים למשפחת PON מאפשר הגנה מהירה ויעליה כנגד הרעלות. נמצא, שהאנזים ממשפחת PON האנושי – pon1, הוא המועמד המתאים ביותר להיות ה ''מטאטא הביולוגי''. תכונותיו של האנזים pon1 האנושי רבות (פירוק רעלי עצבים, פירוק לקטון ומניעת טרשת עורקים). לאחר ניסויים באנזים הנ''ל, התגלתה חוסר יציבותו ונטייתו ליצור חלקיקים לא מסיסים וחסרי פעילות. מטרתנו היא להחדיר pon1 רקומבננטי לחיידקי E.coli ליצירת מוטנטים יציבים של pon1 שישמשו כ ''מטאטאים ביולוגיים'' יעילים של גזי עצבים.

מאמר שני- אטרופין

סיכום מאמר how it works: atropine, the nerve gas antidote

המאמר שבכותרת מסביר את אופן הפעילות של "אטרופין", תרופה נגד גז עצבים. על פי המאמר ישנם שני נתיבים למערכת העצבים האנושית: הנציב הרצוני והנתיב הבלתי רצוני. הנתיב הרצוני אחראי על כל הפעילויות המכניות הרצוניות שבגוף האדם היינו פעילות השרירים. הנתיב הבלתי רצוני מחולק לשני מנגנונים: הסימפטטי והפרסימפטטי. הסימפטטי אחראי בעיקר על פעולות אינסטינקביות (""FIGHT OR FLIGHT). הפרסימפטטית אחראית על פעולות מכניות בגוף האדם אשר אינן בשליטת האדם כגון מערכת העיכול.

על פי המאמר גז עצבים משפיע בעיקר על המערכת הפרסימפטטית על ידי חסימת הניורוטרנזמיטר אציטל-כולין-אסטרז (acetylcholinesterase) אשר מפרק את המוליך העצבי אציטוכולין. אציטוכולין הוא ניורוטרנזמיטר חשוב אשר אחראי לפעילויות גופניות חשובות מאוד כגון, פעילות תקנית של שריר הלב, המערכת הגסטרואינטסטנית, מערכת השתן, מערכת הנשימה ועוד. ללא הניורוטרנזמיטר אציטל-כולין-אסטרז הגוף אינו יכול למתן את פעילותו של הניורוטרנזמיטר אציטוכולין וכל המערכות אשר הניורוטנזמיטר אציטוכולין אחראי אליהן מאבדות שליטה ומתחילות לעבוד בצורה לא סבירה. הדבר מתבטא בכל מיני סימפטומים אצל אנשים שונים, לדוגמא: אי שליטה במערכות השתן, חוסר פעילות של מערכות הלב והריאות ועוד.

אטרופין הוא התרופה הנפוצה ביותר למלחמה בגז עצבים. השימוש באטרופין נעשה ללא מינון מסוים אלא לכל חולה ניתנת כמות שונה בהתאם להיחשפותו לגז העצבים ובהתאם למצבו הנוכחי בעת לקיחת התרופה. תחילה הרופאים נותנים לחולה כמות התחלתית ומגבירים את הכמות בהתאם לשינוי המצב של המטופל. כמעט בכל עיר יש כמויות של תרופה זו למקרה שאי פעם יצטרכו לו.

מבוא


רקע הסטורי

במהלך המאה ה-20 שכלול שיטות הרג גדלה יותר מאי פעם, ובמיוחד שיטות ההרג הכימיים והביולוגיים השונים. אחת משיטות ההרג הכימיים שפותחו היא שיטת ההרג באמצעות גזים רעילים ובהם גז עצבים. עבודת ביוטק זו מתרכזת באחת משיטות הטיפול החדישות שפותחו נגד גז עצבים והוא השימוש במטאטא הביולוגי PON1.


מערכת העצבים

מערכת העצבים היא אחת ממערכות הגוף החשובות והחיוניות בגוף האדם והיא זו שמושפעת ישירות מגז העצבים.מערכת העצבים מחולקת לשני חלקים עיקריים:


1. מערכת העצבים המרכזית - הגורמת להעברת המידע והפקודות אל איברי הגוף השונים, וקבלת מידע מהם והעברתו אל המוח

2. מערכת העצבים הפריפרית - המערכת הפריפרית כוללת את העצבים היוצאים מחוט השדרה ומעצבבים את האיברים השונים. מערכת זו מחולקת לשתי תת חלקים:
א. המערכת הסומטית- מערכת העצבים הסומטית היא המערכת המאפשרת ביצוע פעולות רצוניות, וכוללת את העצבוב האחראי על תנועה מוטורית ותחושה.

העצבים הקשורים למערכת הסומטית מגיעים אל סיבי השריר וגורמים לכיווצם, ואל העור וגורמים להפקת תחושה, ובדרך זו המערכת ההיקפית מאפשרת שליטה רצונית על הגוף.

ב. המערכת האוטונמית- מערכת זו אחראית על פעולות לא רצוניות בגוף האדם כגון: מערכת העיכול, מערכת כלי הדם וכו... המערכת האוטונמית מחולקת אף היא לשתי חלקים:
1. המערכת הסימפטטית - ערכת העצבים הסימפתטית אחראית על תגובה המכונה "Fight or Flight", כלומר המערכת הסימפתטית מופעלת ברגעי סטרס ותפקידה להכין את הגוף למצב הלחץ.

תגובה זו, גורמת לעליה בלחץ הדם וקצב הלב, הגברת קצב הנשימה, וויסות זרימת הדם אל השרירים והפריפריה ומאפשרת לגוף להתמודד עם אירוע סטרסוגני בצורה טובה.
תגובה זו מופעלת על ידי מערכת העצבים הסימפתטית, המפעילה בתגובה את הלב, כלי דם, מערכת הנשימה וגורמים נוספים אשר מאפשרים את התגובה הסימפתטית.

2. המערכת הפרסימפטטית - מערכת העצבים הפראסימפתטית גורמת לתגובה ההפוכה מהמערכת הסימפתטית, המכונה "Rest and Digest". זוהי המערכת האחראית לתפקוד הגוף במנוחה והשולטת על מערכת העיכול.

המערכת הפרסימפטטית היא גם המערכת העיקרית בגוף אשר מושפעת ישירות במקרה של החשפות לגז עצבים.



השפעת גז עצבים על המערכת הפרסימפטטית

כשאדם נחשף לגז עצבים נגרמת הפרעה חמורה במערכת הפרסימפטטית במערכת העצבים שלו. גז העצבים חוסם את הניורוטנזמיטר אציטל-כולין-אסטרז(acetylcholinesterase) אשר אחראי על פירוק הניורוטנזמיטר אצטיל כולין. דבר זה גורם לתופעות לואי חמורות ביותר משום שאצטיל כולין אחראי על פעילותם התקינה של מערכות חיוניות לגוף כגון: מערכת השתן, מערכת העיכול, מערכת הנשימה וכו... אי פירוקו של הניורוטרנזמיטר אצטילכולין גורם למינון גבוה מאוד שלו בגוף, ולכן בסופו של דבר מוביל למוות.


טיפול בהרעלת גז עצבים על יד מטאטים ביולוגיים

מטאטא ביולוגי מבוסס על השימוש באנזימים המפרקים גזי עצבים תרכובות אורגנו -זרחתיות ועל ידי כך מונעים את פעולתם, לפני ההגעה ליעדם. כלומר הרעיון הוא מניעת הפעילות של גז עצבים כבר מהרגעים הראשונים (שהם הרגעים הקריטיים) של החשיפה למערכת העצבים על ידי החדרת האנזים למערכת החיסון לפני החשיפה לגז העצבים.

איזה מטאטא ביולוגי הוא היעיל ביותר למניעת התוצאות ההרסניות של גזי עצבי?

אנזימים השייכים למשפחת הפאראוקסונאזות (PON) הינם יעילים ביותר לנטרולם ולפירוקם של תרכובות אורגנוזרחתיות. האנזים האנושי PON1 ממשפחת הפאראוקסונאזות הוא האנזים אשר היעיל ביותא מבין אנזימי משפחת הפאראוקסונאזות להיות מטאטא ביולוגי. בנוסף ליעילותו בפירוק גזי עצבים הוא גם בעל מגוון פעילויות הידרוליטיות חשובות כגון: לקטונאז (פרוק לקטון) ופעילות הקשורה במניעת טרשת עורקים, בעקבות היקשרותו לחלקיקי
High Density Lipoproteins) HDL) פעילותו הטבעית של PON1 האנושי מהווה עדיין חידה לחוקרים.

איך האנזים PON1 מופק?

האנזים PON1 מופק בתהליך של שיבוט הגן המקודד לPON1 בחיידקים, ביטויו של האנזים (יצורו), בידודו, ניקויו, גיבושו לגבישים, פענוח המבנה הגבישי שלו באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני X, וניתוח המבנה התלת מימדי של מולקולת החלבון.

כיצד זה מתקשר לעבודת החקר?

עבודת חקר זו עוסקת בהשפעת ריכוזים שונים של 1PON מהווריאנט W.t, בחיידקי E.Coli, על פעילותו והתבטאותו של האנזים. בעבודת חקר זו בעצם ביצענו את כל השלבים להפקת PON1 המנויים למעלה. לאחר שמצאנו את ריכוזי החלבון בדקנו את רמת הפעילות של האנזים בעזרת פראוקסון, אנלוג של גז העצבים. השתמשנו בצלחות 96 בבליעה של 110, ובאמצעות המחשב גילינו האם האנזים מצליח לפרק את הפראוקסון.

כרטיס ניסוי מכין


מטרת הניסוי המכין: העברת הפלסמיד לתוך החיידק.

שלבי עבודה:

1- נותנים שוק תרמי לחיידקים על מנת להחליש את דופנם כדי להחדיר להם את הפלסמיד הרצוי. לפלסמיד יש תכונת עמידות לאנטיביוטיקה אמפיצלין.

2- זורעים במצע את הפלסמיד

3- זריעת החיידקים. זורעים את החיידקים על 3 צלחות. בצלחת הראשונה אמפיצלין, בצלחת השניה אין אמפיצלין, ובצלחת השלישית זרענו חיידקים אשר עברו טיפול אך לא הוחדר אליהם פלסמיד.
Big image


תוצאות:


א. חיידקים שלא עברו טרנפורמציה- לא התפתחו מושבות חיידקים.

ב. חיידקים שלא נזרעו במצע המכיל אמפיצלין- התפתחו מושבות.

ג. חיידקים שעברו טרנספורמציה ושוק תרמי- התפתחו מושבות רבות.

מסקנות: חיידקים במושבה א לא עברו טרנספורמציה ולכן לא התפתחו במצע המכיל אמפיצלין. חיידקים במושבה ג עברו שוק תרמי ונזרעו במושבות בלי אמפיצלין ולכן בתפתחו מושבות רבות. רק חיידקים במושבה ב שלהם החדרנו את הפלסמיד הצליחו לגדול על המצע המכיל אמפיצלין מפני שהיה להם גן המקנה עמידות לאמפיצלין. ובכך בידדנו את החיידקים הרקומביננטים.

דו"ח ניסוי


שאלת המחקר: השפעת ריכוזים שונים של PON1 מהואריאנט W.t, בחיידקי E.coli, על פעילות האנזים.

שיטות וחומרים:ביטוי הטרנסגן של PON1 בחיידקים (תחת בקרת אופרון הלקטוז)

הטרנסגן מבוטא תחת בקרה של אופרון הלקטוז. אופרון הלקטוז מבוקר באמצעות הוספת המשרן IPTG בריכוזים שונים ובתנאים שונים (של טמפרטורה וזמן) ומאפשר לקבל ביטוי אופטימלי של האנזים. צפוי שיתקבלו וריאנטים שונים של האנזים בהתאם לסוג הטרנסגן שהוחדר לחיידק.

פיצוץ כימי של החיידקים

כאשר הביטוי יעיל רוב החלבונים בתא החיידק יהיו מסוג החלבון הרצוי PON1. להפקת החלבון מתא החיידק, יש להשתמש בתמיסה המכילה למשל את האנזים ליזוזים שמזרז את פירוק דופן תא החיידק וגם דטרגנט כלשהו המפרק את קרום תא החיידק. החלבון מופרד משאר מרכיבי התא ע"י סרכוז כאשר בסוף תהליך זה נקבל את שברי התאים כמשקע ואת החלבונים (החלבון הרצוי + חלבוני החיידק) כתרחיף (הנוזל העליון = ליזט).


ניקוי החלבון בעזרת קולונה זיקה (קולונת ניקל)

הנוזל שהתקבל לאחר פיצוץ התאים מכיל תערובת של חלבונים שבוטאו בחיידקים, ביניהם החלבון PON1.

ההפרדה של החלבון PON1 נעשית באמצעות קולונת זיקה. החלבון הרצוי עבר איחוי עם פפטיד הכולל רצף של 8 חומצות אמינו מסוג היסטידין. תוספת זו מאפשרת קישור ספציפי של החלבון לחרוזי הניקל שבקולונה בגלל הזיקה הגבוהה של הניקל לטבעת האימידזולית של היסטידין. קשירת החלבון PON1 והפרדתו משאר החלבונים ולאחר מכן הדחת החלבון מהקולונה מתבצעות באמצעות ריכוזים שונים של אימידזול חיצוני המתחרה עם החלבון PON1 על הקישור לניקל.


בדיקת רמת ביטוי החלבון על ידי אלקטרופורזה ב- SDS-PAGE

אלקטרופורזה היא שיטה המאפשרת הפרדת חומרים המצויים בתערובת על גבי ג'ל העשוי מפולימר הקרוי פוליאקרילאמיד בשדה חשמלי .

בשיטה זו לפני ההפרדה מוסיפים לתערובת החלבונים את החומר SDS (סודיום דודציל סולפט). SDS גורם לדנטורציה של החלבון ולטעינתו במטען שלילי. ההפרדה של החלבון של החלבון PON1 משאר החלבונים תהיה מבוססת על מסתם המולרית של החלבונים. ככל שמולקולות החלבון קטנות יותר, תנועתן לעבר האלקטרודה החיובית מהירה יותר, ולהיפך. כך ניתן להפריד את החלבונים על -פי הגודל, להעריך את גודלו של החלבון הרצוי על –פי השוואה לסמני גודל ידועים ולקבוע את רמת ביטוי החלבון הרצוי לפי הצבע ועובי הפס המתקבל.


בדיקת רמת פעילות אנזימטית (מכשיר אלייזה)

לבדיקת הפעילות האנזימטית של החלבון מספר מטרות:

1. בדיקת פעילות האנזים מלמדת על דרגת הניקוי של האנזים PON1 שהופק. ככל שהאנזים נקי יותר, כך גבוה יותר היחס בין פעילות האנזים לריכוז החלבון הכללי של תאי החיידק.

2. מאחר ולפאראוקסונזות סובסטרטים ופעילויות שונות, נבדקה פעילותו של כל וריאנט על שלשה סובסטרטים שונים. נבדקה הפעילות כפוספוטריאסטראז (פראוקסון), כלקטונאז (גאמא-בוטירו-טיולקטון) וכאסטראז (2-נפטיל- אצטאט).

3. כדי ללמוד על מבנה האתר הפעיל והמנגנון הקטליטי נבדקה פעילותו של הואריאנט הדומה לזן הבר, עבור שני סובסטרטים בטווח רחב של pH, ונקבעה יעילותו הקטליטית בכל pH ((Kcat/Km דהיינו היחס בין מהירות הפירוק של התצמיד ES ליעילות הקישור בין האנזים לסובסטרט.

Kcat – מספר מולקולות הסובסטרט שמשתנות לתוצר על-ידי מולקולת אנזים אחת ביחידת זמן, כשהאנזים פועל במהירות מירבית. במילים אחרות: המספר המירבי של תגובות אנזימטיות שאנזים יכול לעשות ביחידת זמן (בדרך כלל בשניה). ערך זה הוא ערך נתון וקבוע לאנזים מסוים על סובסטרט מסוים, בתנאים מוגדרים של pH וטמפרטורה.









Km – ריכוז סובסטרט המביא למחצית מהמהירות המרבית של פעילות האנזים. ערך זה הוא ערך נתון וקבוע לאנזים מסוים על סובסטרט מסוים, בתנאים מוגדרים של pH וטמפרטורה. ככל שערכו קטן יותר מהירות התגובה המקסימלית גדולה יותר.

תוצאות

Big image
Big image

מסקנות

Big image