Biotech 2016
ביטוי ואפיון האנזים PON1 ככלי ביוטכנולוגי לפירוק גז עצבים
בשיתוף מכון ויצמן למדע
כיצד משפיע זמן הדגרת החיידקים במשרן IPTG על ביטוי הגן המקודד לוריאנט W.T של PON1?
שמות המבצעים:
-איתמר זך
שמות המנחים במכון וייצמן:
שם המורה:
רקע מדעי
שאלת המחקר:
השערת המחקר:
משתנים:
נמדוד את רמת ביטוי הגן המקודד לPON1 בהרצה באלקטרפורזה בג'ל- ככל שהפס שהתקבל עבה או כהה יותר, כך רמת הביטוי גבוהה יותר.
המשתנה הבלתי תלוי- זמן הדגרת החיידקים הרקומביננטיים במשרן IPTG.
נבדוק את רמת הביטוי כל חצי שעה, החל מאפס דקות, במשך 3 שעות- משמע 7 מבחנות ניסוי.
בקרה:
הסיבה לכך היא שבכל פעם אנו משנים את המשתנה הבלתי תלוי- זמן ההדגרה במשרן IPTG, ומשווים בין הזמנים השונים.
חזרות:
בגלל חוסר בזמן לא ביצענו חזרות על כל זמן הדגרה בנפרד.
ניסוי מקדים
שלב I - טרנספורמציה
תיאור השלב: נתחיל עם שתי מבחנות:
- מבחנת הניסוי- מכילה מצע גידול נוזלי LB + חיידקים, פלסמידים רקומביננטים ויוני סידן.
- מבחנת הבקרה- תכיל את כל מרכיבי מבחנת הניסוי מלבד הפלסמידים הרקומביננטים.
על מנת לייעל את חדירת הפלסמידים לתאי החיידקים, נשתמש ב-2 שיטות:
יוני סידן: תפקיד יוני הסידן לגשר בין הפלסמיד הרקומביננטי לבין דופן תא החיידק. גישור זה מתבצע משום שלפלסמיד ולדופן התא יש מטען שלילי, ויון הסידן הינו יון דו ערכי חיובי, לכן יהיו כוחות משיכה.
שוק תרמי: ראשית נקרר את החיידקים באמבט קרח על מנת להעצים את השוק שעתיד לבוא, ומיד לאחר מכן נחמם לטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס על מנת לפתוח את הנקבים שבממברנה דרכם יעברו הפלסמידים בקלות. לאחר מכן, נחזיר את החיידקים לאמבט קרח לשם כיווץ הנקבים בחזרה כדי לחסום את יציאת הפלסמידים. לבסוף, נחזיר את החיידקים לטמפרטורה האופטימלית שלהם כדי שגידול החיידקים יהיה אפקטיבי ביותר.
שלב II - זריעה וברירה של החיידקים הטרנסגניים
1. מכילה אגר עם אמפיצילין שעליה נזרע חיידקים ממבחנת הניסוי. המטרה בצלחת 1 היא לברור בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד לבין אילו שלא דרך הגן לעמידות לאמפיצילין שנמצא על הפלסמיד.
2. מכילה אגר עם אמפיצילין וחיידקים ממבחנת הבקרה. המטרה בצלחת 2 היא לבדוק שלחיידקים אין עמידות טבעית לאמפיצילין.
3. מכילה אגר וחיידקים ממבחנת הניסוי. המטרה בצלחת זו היא לבדוק שאין שום דבר במהלך הניסוי שגרם למותם, אלא רק האמפיצילין.
תוצאות הניסוי המקדים
הבקרה החיובית-
כפי ההשערות, החיידקים אשר זרענו על צלחת זו התרבו בהצלחה וגדל מרבד רחב של מושבות על פני הצלחת. החיידקים אשר גדלו בבקרה החיובית הם חיידקים רקומביננטיים וגם חיידקים שאינם רקומביננטיים מסוג E.Coli.
הבקרה השלילית:-
כפי ששיערנו, לא גדלו מושבות חיידקים.
צלחת הניסוי-
בניגוד להשערתנו, לא גדלו מושבות חיידקים, אף על פי שעברו את שלבי הטרנספורמציה והזריעה לפי ההוראות והפרוטוקול.
טבלת תוצאות הניסוי המקדים
דיון בתוצאות הניסוי המקדים
ניתן להגיד כעת כי אין גורם אחר הגורם לתמותת החיידקים מלבד האמפיצילין
הבקרה השלילית:-
סביר להניח כי כל החיידקים לא שרדו משום שלא הייתה להם עמידות לאמפיצילין בשום אופן טבעי.
צלחת הניסוי-
הסיבה לתמותת החיידקים הייתה כנראה טרנספורמציה לא מוצלחת, שהייתה יכולה להתרחש משלל סיבות שאין באפשרותנו לדעת.
למזלינו, לניסוי המקדים שלנו לא היה קשר להמשך הניסוי בשל מגבלת הזמן הבית ספרית. לניסוי שלנו קיבלנו חיידקים רקומביננטים שעברו טרנפורמציה מוצלחת, ואיתם עברנו את הניסוי.
ניסוי החקר
1. שם השיטה: גידול החיידקים הרקומביננטיים עד לאמצע השלב הלוגריתמי.
מטרת השיטה: לקבל כמות גדולה של חיידקים רקומביננטיים שיבטא ויסנתזו בהמשך את האנזים PON1
תיאור השיטה: מגדלים את החיידקים שנלקחו מהניסוי המקדים (צלחת הניסוי) במצע גידול נוזלי LB. מוסיפים למצע הגידול אמפיצילין, על מנת שמערכת הניסוי לא תזדהם עקב סביבה לא סטרילית שבה עבדנו בניסוי המקדים. בנוסף, נוסיף למצע הגידול יוני סידן על מנת שהחיידקים יוכלו לסנתז את הPON1 המכיל אותם באתר הפעיל שלו. את החיידקים מטלטלים על מנת את חדירות החמצן, מה שיעזור לחיידקים ארוביים. על מנת לדעת שהחיידקים אכן הגיעו לאמצע השלב הלוגריתמי, נבדוק את רמת הבליעה באורך גל של 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר רמת הבליעה מגיעה לטווח של 0.6-0.8OD, נעצור את גידולם. מבחנת הבלנק מכילה את מצע הגידול בלבד.
2. שם השיטה: הפקת כלל חלבוני התא.
מטרת השיטה: הוספת IPTG על מנת שהחיידקים יבטאו את הגן ל- PON1 תחת בקרת אופרון הלקטוז המהונדס.
תיאור השיטה: אנו משתמשים במשרן IPTG, שהוא אנאלוג נפוץ של לקטוז, על מנת שייקשר לרפרסור ויאפשר תיעתוק של הגן הרצוי, ולבסוף ייצור של החלבון שהגן מקודד לו. עקרונית, השימוש בלקטוז היה אפשרי, אך לו חסרונות שלא קיימים ל- IPTG. ראשית, המשרןIPTG אינו מפורק ע"י החיידק, לכן רמתו נשארת קבועה, בניגוד ללקטוז אותו החיידק מנצל כמקור לפחמן ואנרגיה. כמו כן, ישנו יתרון נוסף ל- IPTG- הוא מסוגל להיכנס לתא באמצעות דיפוזיה, לא כמו הלקטוז שכניסתו אל התא תלויה בנשא. (lacY).
במסגרת שאלת החקר שלנו, בשלב זה נכנס המשתנה התלוי שלנו לתמונה. נדגיר את החיידקים שלנו במשרן IPTG בטווח של 3 שעות, ונבדוק את זמן ההדגרה כל חצי שעה, ביחידות מידה של דקות- 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180
3. שם השיטה: סרכוז בצנטריפוגה והפרדת מצע הגידול מהחיידקים.
תיאור השיטה: צנטריפוגה הוא מכשיר שמפריד חומרים על פי צפיפותם. ככל שחומר בעל צפיפות גבוהה יותר הוא כבד יותר, ולכן מצטבר קרוב לתחתית המבחנה. כעת, יש לנו צורך אך ורק בחיידקים הטרנסגניים בהם נמצא הPON1, ולכן נשתמש בצנטריפוגה על מנת להפריד אותם ממצע הגידול הנוזלי שלהם.
4. שם השיטה: פיצוץ תאי החיידקים
תיאור השיטה: כדי לשחרר את כלל החלבונים מהתאים, נשתמש בתמיסת פיצוץ שנקראת Bug Buster, ולה ארבעה מרכיבים.
- - ליזוזים- אנזים שמפרק את דופן תא החידק.
- דטרגנט- סבון המפרק את המרכיב השומני של קרום התא.
- נוקלאזות- אנזים המפרקים DNA\RNA על מנת לקבל תמיסה צלולה ולא צמיגית.
- -PIC- קוקטייל מעכבי פרוטאזות-( אנזימים שמפרקים חלבונים ונמצאים בתוך התא) כדי שאנזימים אלו לא יפרקו את PON1.
5. שם השיטה: סרכוז נוסף בצנטריפוגה
תיאור השיטה: לאחר הסרכוז בצנטריפוגה, שברי הקרומים שקעו, ונמשיך עם הנוזל בעל הצפיפות הנמוכה יותר, שמכיל את החלבונים שתאי החיידקים סנתזו- ליזט.
6. שם השיטה: ניקוי החלבון בעזרת קולונת ניקל
תיאור השיטה: לניקל יש זיקה לטבעת אימידוזולית, ועל עקרון זה מבוססת השיטה. בפלסמיד הרקומביננטי שלנו, הודבק מקטע DNA קצר שמאוחה לגן שמקודד לPON1, וכאשר מקטע זה מתבטא, יווצר לPON1 זנב של 8 חומצות אמינו מסוג היסטדין. במולקולת ההיסטדין, ישנה טבעת אימידוזולית, מה שמקנה לPON1 יתרון היקשרות לניקל על פני שאר החלבונים. לשיטה זו שני שלבים-
1. בופר שטיפה:
נשים בקולונת הניקל את הנוזל שהתקבל מהסרכוז הנוסף בצנטריפוגה- הליזט, לצד בופר שטיפה. תפקיד בופר השטיפה לשמור על pH קבוע ואופטימלי לPON1, ומכיל ריכוז נמוך של אימידוזול. לכן, ה- PON1 ייקשר לניקל, ושאר החלבונים ישטפו דרך המסננת אשר שומרת על חרוזי הניקל מנפילה. הסיבה שיש ריכוז אימידוזול קטן, היא למנוע מחלבונים אחרים מהיקשרות לחרוזי הניקל במקרה שכל ה-PON1 כבר נקשר.
2. בופר הדחה:
בשלב זה, נשתמש בבופר עם ריכוז אימידוזול גבוה, אשר לו זיקה גבוהה יותר לחרוזי הניקל מאשר ה- PON1. מטרת שלב זה היא להדיח את ה- PON1 שקשור לחרוזי הניקל, אל מבחנה שעתידה להכיל ברובה את הPON1 ואיתה נמשיך לבדיקת שאלת המחקר.
במסגרת הניסוי שלנו, השתמשנו בשבע קולונות זיקה, ולכל קולונה המיוחסת לזמן הדגרה שונה, הוצבו שלושה בופרי שטיפה, שתפקידם היה להפריד את PON1 משאר חלבוני התא, ולאחר שלושת בופרי השטיפה בא בופר אילוציה (הדחה) אחד עבור כל אחת מן הקולונות.
7. שם השיטה: בדיקת ריכוז החלבון שהתקבל באמצעות ספקטרופוטומטר בריאגנט ברדפורד
תיאור השיטה: בשלב זה נמצא את ריכוז החלבון במבחנה שאיתה התקדמנו בעזרת עקומת כיול שהכינו לנו מראש (נמצאת בפרוטוקול). נציב במשוואה את רמת הבליעה של החלבון שקיבלנו ונמצא את ריכוזו.
כדי שנוכל למדוד את רמת הבליעה של החלבון נצטרך להקנות לו צבע מסוים שהספקטרופוטומטר יקלוט. מכיוון שצבעו הטבעי של החלבון הוא לבן נשתמש בשיטת ברדפורד אשר מבוססת על קשירת הצבע Coomasue Brilliant Blue לחלבון. כתוצאה מכך, החלבון ייצבע בכחול עז באורך גל של 595nm.
כדי שנוכל לקבוע בדייקנות את רמת הבליעה של החלבון בלבד, ללא רמת הבליעה של שאר מרכיבי המבחנה, נשתמש במבנת בלאנק שתפקידה לאפס את הספקטרופוטומטר. מבחנת הבלאנק, אשר מכילה בופר אילציה בנפח (5 מיקרוליטר) ותמיסת ברפורד מהולה בנפח (995 מיקרוליטר)
8. שם השיטה: בדיקת רמת הביטוי של PON1 בעזרת הרצת החלבון באלקטרופורזה בג'ל
תיאור השיטה: כפעולה מקדימה, נוסיף לחלבון:
- SDS - על מנת להקנות לחלבון מטען שלילי ( שיוכל לנוע באלקטרופורזה בג'ל לכיוון האנודה), ולשבור את קשרי המימן כדי שנוכל להריץ מולקולת חלבון לינארית ולא בעלת מבנה מרחבי שיכול להשפיע על מרחק הריצה.
- D.T.T- לשם פירוק הקשרים הדי- סולפידים (S-S) שיבטלו את מבנו המפותל של החלבון.
- רתיחה- לשם הרס המבנה המרחבי של החלבון ע"י גרימה לדנטורצית החלבון.
לאחר הוספת החומרים SDS וD.T.T לחלבון, נריץ סמני גודל שהם חלבונים בעלי גודל ידוע בבאר אחת, ובשאר הבארות נריץ את ריכוזי הPON1 שהתקבלו בזמני ההדגרה בIPTG השונים בדקות- 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180.
ככל שהפס המתקבל עבה ובעל צבע כהה יותר עבור ערך של 40KD, משמע רמת ביטוי גבוהה יותר של החלבון PON1.
ככל שגודל החלבון קטן יותר, כך הוא ירוץ באלקטרופורזה רחוק יותר, ועל עקרון זה מתבססת ההרצה.
הרצת ריכוזי הPON1 שהתקבלו בזמנים השונים
מבחנות האפנדורף וקולונות הניקל באופן מסודר לפני השימוש
הספקטרופוטומטר בו השתמשנו
תוצאות המחקר
התחלנו את הניסוי משום שרמת הבליעה הייתה בטווח הראוי
בשיטה הספקטרופוטומטרית- בדיקת ריכוז החלבון שהתקבל
לאחר חישוב ריכוז החלבון, חישבנו את כמות החלבון שהתקבל, על ידי הכפלת הריכוז שהתקבל עבור הערכים השונים כפול נפח בופר האילוציה (=75 מיקרוליטר), על פי הנוסחה.
חשוב לציין כי ערכי ריכוז החלבון אטשר התקבלו אינם מתייחסים אך ורק ל-PON1, אלא לכלל חלבוני התא אשר הופקו, ולכן אין קשר ישיר בין תוצאות השיטה הספקטרופוטומטרית לבין שיטת ההרצה בג'ל. כעבור שעה אחת (60 דקות) קיבלנו את ריכוז החלבון הכי גבוה- אך לאו דווקא ריכוז ה-PON1.
בדיקת רמת ביטוי
ניתוח התוצאות בהרצה בג'ל (SDS-PAGE) -
דיון בתוצאות ומסקנות
התייחסות לגרף ריכוז החלבון כתלות בזמן ההדגרה (בראדפורד)
הגרף שהתקבל מוכיח כי משך הדגרה של שעה מפיקה את הריכוז הגבוה ביותר של כלל חלבוני התא. חשוב להזכיר כי אין לכך קשר ישיר לרמת ביטוי החלבון PON1, משום שריאגנט בראדפורד נקשר גם לחלבוני תא אחרים, אשר נלקחים בחשבון בבדיקת ריכוז החלבון. אף על פי ההפרדה שקיימנו בקולונות, סביר להניח שהניקיון לא היה יסודי לגמרי, ושכמה חלבוני תא אחרים הצליחו להישאר במבחנת ה-PON1 שהתקבלה לאחר בופר ההדחה.
התייחסות להרצה בג'ל
השערתנו אוששה- ככל שהדגרנו את החיידקים הרקומביננטיים יותר זמן בIPTG, במסגרת הזמנים שהייתה לנו, רמת הביטוי שקיבלנו הייתה גבוהה יותר.מצאנו כי הזמן האופטימלי להשראת החיידקים במשרן IPTG כדי שיבטאו את PON1 בוריאנט W.T הוא 3 שעות. בבסיס ההשערה, ככל שנשרה את החיידקים הרקומביננטיים ב-IPTG זמן רב יותר, כך החלבון תחת בקרת אופרון הלקטוז יבוא לידי ביטוי ברמה גבוהה יותר משום שבזכות ה-IPTG (אנאלוג ללקטוז) מתאפשרת בכלל פעולת הRNA Polimerase, ובסופו של דבר סנתוז החלבון עצמו.
לא הדגרנו את החיידקים הרקומביננטיים במשרן IPTG לזמן שארוך משלוש שעות, גם בגלל מגבלת הזמן שהייתה לנו, אך בעיקר משום שלאחר 3 שעות של הדגרה, החיידקים מסנתזים כמות רבה מדי של PON1 אשר מפריעים לתפקוד החיידק. לכן, החיידק כולא את הPON1 בגופיפי הסגר שבתוכם מולקולות הPON1 נקשרות אחת לשנייה, יוצרות אגרגטים, וכך הPON1 אינו מסיס ואינו פעיל.
הצעות לשיפור
חווינו הרבה היסוסים במהלך הניסוי שהיו עלולים להוביל לכישלון בניסוי, שככל הנראה נבעו ממחסור בזמן ולחץ של ניסוי חד פעמי שהצלחתו קריטית עבורנו. לשם שיפור הניסוי, היינו מציעים כמה שעות נוספות לניסוי, שיוכלו להפחית את הלחץ. בנוסף, בהתייחסות לשאלת המחקר שלנו, היינו רוצים לדעת אם עבור טווח זמנים גדול יותר של הדגרה ב-IPTG הייינו מקבלים רמת ביטוי גבוהה יותר מאשר שקיבלנו בשלוש שעות.
הצעות לכיווני המשך
לאחר ביצוע הניסוי והפקת מסקנות, עלתה בדעתנו השאלה- איך נמשיך מפה? לפי דעתנו, ניתן להמשיך את הניסוי על ידי חזרות רבות של שאלת המחקר שלנו, קבלת רעיון כללי ומדויק לגבי זמן ההדגרה האופטימלי במשרן IPTG.
לאחר קבלת רעיונות כלליים לגבי תנאים אופטימליים לביצוע הניסוי, וקבלת רעיון לגבי ההפקה האידיאלית של חלבון ה- PON1- יש להתחיל בייצורו. ישנם מצבים רבים בעולם בהם יש שימוש בנשק כימי מסוג גז העצבים, וזוהי האפשרות הטובה ביותר להציל את הקורבנות. הניסויים אשר אנו ביצענו ואלו שיבוצעו בעתיד יתרמו להפקה ברמה מקסימלית וטובה של האנזים PON1, ולבסוף להצלת חיים רבים של בני אדם הנתונים בסכנות.
התייחסות לקבוצת המחקר
לאחר התייחסות לקבוצת המחקר שלנו, ששאלת מחקרה הייתה דומה לשלנו מלבד לוריאנט ( 8C8- הוריאנט שלהן), גילינו כי הזמן האופטימלי להדגרת החיידקים הרקומביננטיים במשרן IPTG בוריאנט 8C8 הינו גם 3 שעות. מה זה אומר? סוג הוריאנט של PON1 אינו מהווה גורם משפיע לזמן הדגרה אופטימלי.
מצד שני, מסקנה זו אינה תקפה לגמרי, משום שלא נבדק הוריאנט H115W תחת שאלת המחקר שלנו, לכן אין לדעת אם הזמן האופטימלי להדגרת החיידקים במשרן IPTG דומה.
הגרף
על פי הגרף, ניתן לראות באופן מובהק את ערכי הזמן בהם מתקבל איכוז החלבון הגבוה ביותר, עבור כל וריאנט. בוריאנט שלנו, W.T, הזמן לו העמודה הגבוהה ביותר היא כעבור 60 דקות= שעה , בעוד בוריאנט 8C8 העמודה הגבוהה ביותר היא כעבור 120 דקות= שעתיים. קיימת סתירה. מדוע הזמנים האופטימליים שונים בין הוריאנטים? התשובה מסתתרת מאחורי העובדה שריכוז חלבוני התא אינו מעיד באופן ישיר על כמות הPON1 שיוצר, אלא על כלל חלבוני התא שלא נוקו כפי שקיווינו בקולונות.
ביבליוגרפיה
- המחברת
- אתר מכון ויצמן
- ויקיפדיה
- הפרוטוקולים שבעזרתם ביצענו את הניסוי
- המאמר המרכזי- "ביטוי ואפיון של האנזים PON1 ככלי ביוטכנולוגי לפירוק גז עצבים", אשר עובד על ידי צוות מורים מומחים.
תודות
לגדי ערמוני וירדנה דוד, אשר עזרו לנו במשך הניסוי והנחו אותנו.
למכון ויצמן שאפשר לנו לבצע את הניסוי במעבדותיו ועל האירוח הנחמד.