Biotech 2016

ביטוי ואפיון האנזים PON1 ככלי ביוטכנולוגי לפירוק גז עצבים

בשיתוף מכון ויצמן למדע

כיצד משפיע זמן הדגרת החיידקים במשרן IPTG על ביטוי הגן המקודד לוריאנט W.T של PON1?

שמות המבצעים:

-איתי קנין

-איתמר זך

בשיתוף עם מכון ויצמן

תיכון הדרים, י"א2, הוד השרון

שמות המנחים במכון וייצמן:

גדי ערמוני וירדנה דוד

שם המורה:

ענת קפלן

רקע מדעי

לאורך ההיסטוריה מצא האדם דרכים שונות ומגוונות לשכלל את שיטות ההרג שלו מטבעו. לאור התפתחות הטכנולוגיה, התפתחו לצד התוצרים הכימיים שנועדו לייעל לאדם, גם נשקים כימיים וביולוגיים מסוכנים, ביניהם גז העצבים. גז העצבים הינו תרכובת אורגנוזרחתית חסרת ריח צבע וטעם בטמפ' החדר, חומר מסוכן ורעיל לכל יצור חי. גז העצבים גורם לפרכוסים ועוויתות , ולתסמונת האדם הנוזל ( בה האדם לא שולט על סוגריו והפרשות גופו) ולבסוף למוות בלתי נמנע כתוצאה מרפיון מוחלט של השרירים. לפני שנדבר על פעילותו של גז העצבים, עלינו להבין כיצד פועלת מערכת העצבים- מערכת העצבים מחולקת ל-2: מרכזית, אשר כוללת את מח הגולגולת ומוח השדרה, והמערכת ההיקפית מכילה את תאי העצב. תאי העצב תפקידם לקלוט גירויים פנימיים וחיצוניים, להגיב למידע המועבר אליהם ולהעביר את מידע זה לתאי המטרה שלהם בעזרת אותות חשמליים העוברים לאורך תא העצב, ואותות כימיים בין תאי העצב. האותות הכימיים מועברים בין התאים במרווח הסינפטי, בעזרת הפרשות משלפוחיות של חומרים הנקראים נוירוטרנסמיטורים, הנקשרים לרצפטורים בתא הפוסט סינפטי, וכך מעבירים את המידע על הגירוי. קיימים כ- 50 נוירוטרנסמיטורים, ביניהם האצטילכולין שלו חשיבות רבה בניסוי שלנו. לאצטילכולין שלושה תאי מטרה- תא עצב, תא שריר, ותא בלוטה. תפקיד האצטילכולין מוגבל בזמן, ויש אנזים במרווח הסינפטי אשר תפקידו לפרק את האצטילכולין ולהגביל את פעילותו על מנת שלא יפעל מבלי קשר לגירוי, ושמו אצטילכולין אסטראז (Ach). גז העצבים, נקשר לאנזים זה בקשרים קוולנטים חזקים, ומשמש כמעכב בלתי הפיך וגורם לאינאקטיבציה מוחלטת של האנזים. דבר זה מוביל להיקשרות של האצטילכולין לרצפטורים ללא הפסקה ומפעילים את תאי המטרה מבלי קשר לגירוי וזה גורם לשרירים להתכווץ, לשריר הלב להרפיה, ולהפרשות לא רצויות של תאי בלוטה, כמו דמעות, זיעה רוק ואף שתן וצואה. במהלך האיומים של גז העצבים על האנושות, ניסו רבים לפתח תרופות שימנעו את פעילות גז העצבים. הטיפול שקיים כיום כנגד גז עצבים הוא אטרופין. האטרופין מצוי בצמח האטרופה ממשפחת הסולניים. האטרופין נקשר לקולטנים של האצטילכולין, וכך מצמצם את פעילותו, וכך באופן ישיר תאי המטרה פועלים בעוצמה נמוכה יותר. אך לאטרופין חסרונות- הוא גורם לנזק נוירולוגי, ובניגוד לאנזים, הוא לא ניתן לשימוש חוזר ומתבזבז. כמו כן, איו מטפל בשורש הבעיה. פה האנזים שאנו זקוקים לו - PON1 נכנס לסיפור. ישנה משפחת אנזימים של פאראוקסונאזות הנקראת PON, לה כמה סוגים, ביניהם PON1, שלו ארבעה סובסטרטים קיימים, ביניהם תרכובות אורגנזורחתיות- כמו גז העצבים. PON1 מסונתז בכבד של האדם , אך בכמויות מזעריות ומופרש לנוזל הדם. PON1 הינו אנזים שמטפל בשורש הבעיה, הוא מפרק את גז העצבים וכך מונע את פעילותו, אך הבעיה היא שהוא לא מופק בצורה טבעית בכמויות רבות, והוא לא יציב. לכן, הגיעו לPON1 יציב (כימרה), המורכב מ-4 משפחות של גנים המקודדים לPON1 בארבעה בעלי חיים שונים- ארנבת, חולדה, בן אדם ועכבר. ל-PON1 שלושה וריאנטים, כולם הושגו לאחר שימוש בשיטת האבולוציה המכוונת . אז איך נפיק PON1 בכמויות רבות בתנאים אופטימליים ומוכן לשימוש? כאן אנו נכנסים לתמונה. בשיתוף עם מכון ויצמן למדע נבדוק את התנאים האופטימליים לייצור ה-PON1.

שאלת המחקר:

כיצד משפיע זמן הדגרת החיידקים הרקומביננטיים במשרן IPTG על ביטוי הגן המקודד לPON1 בוריאנט W.T?

השערת המחקר:

אנו משערים כי ככל שנדגיר את החיידקים הרקומביננטיים במשרן IPTG זמן ארוך יותר, נקבל יותר PON1, כל זאת במסגרת הזמנים שלנו. אין ביכולתנו לדעת אם לאחר זמנים ארוכים מהזמן המקסימלי שלנו נקבל אכן ביטוי גבוה יותר של PON1, או ביטוי נמוך יותר.

משתנים:

המשתנה התלוי- רמת ביטוי הגן המקודד לPON1 (חלבון), בוריאנט W.T.

נמדוד את רמת ביטוי הגן המקודד לPON1 בהרצה באלקטרפורזה בג'ל- ככל שהפס שהתקבל עבה או כהה יותר, כך רמת הביטוי גבוהה יותר.

המשתנה הבלתי תלוי- זמן הדגרת החיידקים הרקומביננטיים במשרן IPTG.

נבדוק את רמת הביטוי כל חצי שעה, החל מאפס דקות, במשך 3 שעות- משמע 7 מבחנות ניסוי.

גורמים קבועים:

- סוג החיידקים E.Coli

- וריאנט W.T.

- טמפרטורה

- ריכוז IPTG

בקרה:

הבקרה בניסוי שלנו היא פנימית השוואתית.

הסיבה לכך היא שבכל פעם אנו משנים את המשתנה הבלתי תלוי- זמן ההדגרה במשרן IPTG, ומשווים בין הזמנים השונים.

חזרות:

חזרות חשובות לבדיקת מהימנות תוצאות הניסוי.

בגלל חוסר בזמן לא ביצענו חזרות על כל זמן הדגרה בנפרד.

ניסוי מקדים

מטרת הניסוי: הכנת חיידקים המכילים את הגן ל-PON1 בוריאנט W.T בשיטות של הנדסה גנטית. על מנת לבצע את הניסוי המקדים נשתמש בשני שלבים עיקריים:

שלב I - טרנספורמציה

מטרת השלב: החדרת הפלסמיד עם הגן לPON1

תיאור השלב: נתחיל עם שתי מבחנות:

  1. מבחנת הניסוי- מכילה מצע גידול נוזלי LB + חיידקים, פלסמידים רקומביננטים ויוני סידן.
  2. מבחנת הבקרה- תכיל את כל מרכיבי מבחנת הניסוי מלבד הפלסמידים הרקומביננטים.


על מנת לייעל את חדירת הפלסמידים לתאי החיידקים, נשתמש ב-2 שיטות:

יוני סידן: תפקיד יוני הסידן לגשר בין הפלסמיד הרקומביננטי לבין דופן תא החיידק. גישור זה מתבצע משום שלפלסמיד ולדופן התא יש מטען שלילי, ויון הסידן הינו יון דו ערכי חיובי, לכן יהיו כוחות משיכה.

שוק תרמי: ראשית נקרר את החיידקים באמבט קרח על מנת להעצים את השוק שעתיד לבוא, ומיד לאחר מכן נחמם לטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס על מנת לפתוח את הנקבים שבממברנה דרכם יעברו הפלסמידים בקלות. לאחר מכן, נחזיר את החיידקים לאמבט קרח לשם כיווץ הנקבים בחזרה כדי לחסום את יציאת הפלסמידים. לבסוף, נחזיר את החיידקים לטמפרטורה האופטימלית שלהם כדי שגידול החיידקים יהיה אפקטיבי ביותר.

שלב II - זריעה וברירה של החיידקים הטרנסגניים

תיאור השלב: בשלב זה נשתמש ב-3 צלחות פטריות:

1. מכילה אגר עם אמפיצילין שעליה נזרע חיידקים ממבחנת הניסוי. המטרה בצלחת 1 היא לברור בין החיידקים שקלטו את הפלסמיד לבין אילו שלא דרך הגן לעמידות לאמפיצילין שנמצא על הפלסמיד.

2. מכילה אגר עם אמפיצילין וחיידקים ממבחנת הבקרה. המטרה בצלחת 2 היא לבדוק שלחיידקים אין עמידות טבעית לאמפיצילין.

3. מכילה אגר וחיידקים ממבחנת הניסוי. המטרה בצלחת זו היא לבדוק שאין שום דבר במהלך הניסוי שגרם למותם, אלא רק האמפיצילין.

תוצאות הניסוי המקדים

לאחר ביצוע הניסוי, קיבלנו את שלושת הצלחות הפטריות עליהן זרענו את החיידקים משני הסוגים השונים:
הבקרה החיובית-
כפי ההשערות, החיידקים אשר זרענו על צלחת זו התרבו בהצלחה וגדל מרבד רחב של מושבות על פני הצלחת. החיידקים אשר גדלו בבקרה החיובית הם חיידקים רקומביננטיים וגם חיידקים שאינם רקומביננטיים מסוג E.Coli.
הבקרה השלילית:-
כפי ששיערנו, לא גדלו מושבות חיידקים.
צלחת הניסוי-
בניגוד להשערתנו, לא גדלו מושבות חיידקים, אף על פי שעברו את שלבי הטרנספורמציה והזריעה לפי ההוראות והפרוטוקול.

טבלת תוצאות הניסוי המקדים

Big image
Big image

דיון בתוצאות הניסוי המקדים

הבקרה החיובית-
ניתן להגיד כעת כי אין גורם אחר הגורם לתמותת החיידקים מלבד האמפיצילין
הבקרה השלילית:-
סביר להניח כי כל החיידקים לא שרדו משום שלא הייתה להם עמידות לאמפיצילין בשום אופן טבעי.
צלחת הניסוי-
הסיבה לתמותת החיידקים הייתה כנראה טרנספורמציה לא מוצלחת, שהייתה יכולה להתרחש משלל סיבות שאין באפשרותנו לדעת.
למזלינו, לניסוי המקדים שלנו לא היה קשר להמשך הניסוי בשל מגבלת הזמן הבית ספרית. לניסוי שלנו קיבלנו חיידקים רקומביננטים שעברו טרנפורמציה מוצלחת, ואיתם עברנו את הניסוי.

ניסוי החקר

1. שם השיטה: גידול החיידקים הרקומביננטיים עד לאמצע השלב הלוגריתמי.



מטרת השיטה: לקבל כמות גדולה של חיידקים רקומביננטיים שיבטא ויסנתזו בהמשך את האנזים PON1

תיאור השיטה: מגדלים את החיידקים שנלקחו מהניסוי המקדים (צלחת הניסוי) במצע גידול נוזלי LB. מוסיפים למצע הגידול אמפיצילין, על מנת שמערכת הניסוי לא תזדהם עקב סביבה לא סטרילית שבה עבדנו בניסוי המקדים. בנוסף, נוסיף למצע הגידול יוני סידן על מנת שהחיידקים יוכלו לסנתז את הPON1 המכיל אותם באתר הפעיל שלו. את החיידקים מטלטלים על מנת את חדירות החמצן, מה שיעזור לחיידקים ארוביים. על מנת לדעת שהחיידקים אכן הגיעו לאמצע השלב הלוגריתמי, נבדוק את רמת הבליעה באורך גל של 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר רמת הבליעה מגיעה לטווח של 0.6-0.8OD, נעצור את גידולם. מבחנת הבלנק מכילה את מצע הגידול בלבד.

2. שם השיטה: הפקת כלל חלבוני התא.


מטרת השיטה: הוספת IPTG על מנת שהחיידקים יבטאו את הגן ל- PON1 תחת בקרת אופרון הלקטוז המהונדס.

תיאור השיטה: אנו משתמשים במשרן IPTG, שהוא אנאלוג נפוץ של לקטוז, על מנת שייקשר לרפרסור ויאפשר תיעתוק של הגן הרצוי, ולבסוף ייצור של החלבון שהגן מקודד לו. עקרונית, השימוש בלקטוז היה אפשרי, אך לו חסרונות שלא קיימים ל- IPTG. ראשית, המשרןIPTG אינו מפורק ע"י החיידק, לכן רמתו נשארת קבועה, בניגוד ללקטוז אותו החיידק מנצל כמקור לפחמן ואנרגיה. כמו כן, ישנו יתרון נוסף ל- IPTG- הוא מסוגל להיכנס לתא באמצעות דיפוזיה, לא כמו הלקטוז שכניסתו אל התא תלויה בנשא. (lacY).


במסגרת שאלת החקר שלנו, בשלב זה נכנס המשתנה התלוי שלנו לתמונה. נדגיר את החיידקים שלנו במשרן IPTG בטווח של 3 שעות, ונבדוק את זמן ההדגרה כל חצי שעה, ביחידות מידה של דקות- 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180

3. שם השיטה: סרכוז בצנטריפוגה והפרדת מצע הגידול מהחיידקים.

מטרת השיטה: להפריד את החיידקים מצע הגידול

תיאור השיטה: צנטריפוגה הוא מכשיר שמפריד חומרים על פי צפיפותם. ככל שחומר בעל צפיפות גבוהה יותר הוא כבד יותר, ולכן מצטבר קרוב לתחתית המבחנה. כעת, יש לנו צורך אך ורק בחיידקים הטרנסגניים בהם נמצא הPON1, ולכן נשתמש בצנטריפוגה על מנת להפריד אותם ממצע הגידול הנוזלי שלהם.

4. שם השיטה: פיצוץ תאי החיידקים

מטרת השיטה: הוצאת כלל חלבוני התא מתוך תאי החיידקים

תיאור השיטה: כדי לשחרר את כלל החלבונים מהתאים, נשתמש בתמיסת פיצוץ שנקראת Bug Buster, ולה ארבעה מרכיבים.


  • - ליזוזים- אנזים שמפרק את דופן תא החידק.
  • דטרגנט- סבון המפרק את המרכיב השומני של קרום התא.
  • נוקלאזות- אנזים המפרקים DNA\RNA על מנת לקבל תמיסה צלולה ולא צמיגית.
  • -PIC- קוקטייל מעכבי פרוטאזות-( אנזימים שמפרקים חלבונים ונמצאים בתוך התא) כדי שאנזימים אלו לא יפרקו את PON1.

5. שם השיטה: סרכוז נוסף בצנטריפוגה

מטרת השיטה: הפרדת שברי הקרומים מהחלבונים שתאי החיידקים סנתזו.

תיאור השיטה: לאחר הסרכוז בצנטריפוגה, שברי הקרומים שקעו, ונמשיך עם הנוזל בעל הצפיפות הנמוכה יותר, שמכיל את החלבונים שתאי החיידקים סנתזו- ליזט.

6. שם השיטה: ניקוי החלבון בעזרת קולונת ניקל

מטרת השיטה: להפריד בין החלבון PON1 לבין שאר החלבונים שסנתזו החיידקים, ומצויים כולם בליזט.

תיאור השיטה: לניקל יש זיקה לטבעת אימידוזולית, ועל עקרון זה מבוססת השיטה. בפלסמיד הרקומביננטי שלנו, הודבק מקטע DNA קצר שמאוחה לגן שמקודד לPON1, וכאשר מקטע זה מתבטא, יווצר לPON1 זנב של 8 חומצות אמינו מסוג היסטדין. במולקולת ההיסטדין, ישנה טבעת אימידוזולית, מה שמקנה לPON1 יתרון היקשרות לניקל על פני שאר החלבונים. לשיטה זו שני שלבים-

1. בופר שטיפה:

נשים בקולונת הניקל את הנוזל שהתקבל מהסרכוז הנוסף בצנטריפוגה- הליזט, לצד בופר שטיפה. תפקיד בופר השטיפה לשמור על pH קבוע ואופטימלי לPON1, ומכיל ריכוז נמוך של אימידוזול. לכן, ה- PON1 ייקשר לניקל, ושאר החלבונים ישטפו דרך המסננת אשר שומרת על חרוזי הניקל מנפילה. הסיבה שיש ריכוז אימידוזול קטן, היא למנוע מחלבונים אחרים מהיקשרות לחרוזי הניקל במקרה שכל ה-PON1 כבר נקשר.

2. בופר הדחה:

בשלב זה, נשתמש בבופר עם ריכוז אימידוזול גבוה, אשר לו זיקה גבוהה יותר לחרוזי הניקל מאשר ה- PON1. מטרת שלב זה היא להדיח את ה- PON1 שקשור לחרוזי הניקל, אל מבחנה שעתידה להכיל ברובה את הPON1 ואיתה נמשיך לבדיקת שאלת המחקר.


במסגרת הניסוי שלנו, השתמשנו בשבע קולונות זיקה, ולכל קולונה המיוחסת לזמן הדגרה שונה, הוצבו שלושה בופרי שטיפה, שתפקידם היה להפריד את PON1 משאר חלבוני התא, ולאחר שלושת בופרי השטיפה בא בופר אילוציה (הדחה) אחד עבור כל אחת מן הקולונות.

7. שם השיטה: בדיקת ריכוז החלבון שהתקבל באמצעות ספקטרופוטומטר בריאגנט ברדפורד

מטרת השיטה: למצוא את ריכוז החלבון שיש לנו במבחנה איתה התקדמנו.

תיאור השיטה: בשלב זה נמצא את ריכוז החלבון במבחנה שאיתה התקדמנו בעזרת עקומת כיול שהכינו לנו מראש (נמצאת בפרוטוקול). נציב במשוואה את רמת הבליעה של החלבון שקיבלנו ונמצא את ריכוזו.

כדי שנוכל למדוד את רמת הבליעה של החלבון נצטרך להקנות לו צבע מסוים שהספקטרופוטומטר יקלוט. מכיוון שצבעו הטבעי של החלבון הוא לבן נשתמש בשיטת ברדפורד אשר מבוססת על קשירת הצבע Coomasue Brilliant Blue לחלבון. כתוצאה מכך, החלבון ייצבע בכחול עז באורך גל של 595nm.

כדי שנוכל לקבוע בדייקנות את רמת הבליעה של החלבון בלבד, ללא רמת הבליעה של שאר מרכיבי המבחנה, נשתמש במבנת בלאנק שתפקידה לאפס את הספקטרופוטומטר. מבחנת הבלאנק, אשר מכילה בופר אילציה בנפח (5 מיקרוליטר) ותמיסת ברפורד מהולה בנפח (995 מיקרוליטר)

8. שם השיטה: בדיקת רמת הביטוי של PON1 בעזרת הרצת החלבון באלקטרופורזה בג'ל

מטרת השיטה: בדיקת רמת הביטוי של PON1 תחת זמני הדגרה שונים במשרן IPTG.

תיאור השיטה: כפעולה מקדימה, נוסיף לחלבון:


  • SDS - על מנת להקנות לחלבון מטען שלילי ( שיוכל לנוע באלקטרופורזה בג'ל לכיוון האנודה), ולשבור את קשרי המימן כדי שנוכל להריץ מולקולת חלבון לינארית ולא בעלת מבנה מרחבי שיכול להשפיע על מרחק הריצה.
  • D.T.T- לשם פירוק הקשרים הדי- סולפידים (S-S) שיבטלו את מבנו המפותל של החלבון.
  • רתיחה- לשם הרס המבנה המרחבי של החלבון ע"י גרימה לדנטורצית החלבון.


לאחר הוספת החומרים SDS וD.T.T לחלבון, נריץ סמני גודל שהם חלבונים בעלי גודל ידוע בבאר אחת, ובשאר הבארות נריץ את ריכוזי הPON1 שהתקבלו בזמני ההדגרה בIPTG השונים בדקות- 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180.

ככל שהפס המתקבל עבה ובעל צבע כהה יותר עבור ערך של 40KD, משמע רמת ביטוי גבוהה יותר של החלבון PON1.

ככל שגודל החלבון קטן יותר, כך הוא ירוץ באלקטרופורזה רחוק יותר, ועל עקרון זה מתבססת ההרצה.

תוצאות המחקר

בדיקת אמצע השלב הלוגריתמי - רמת בליעה = 0.615 (OD)

התחלנו את הניסוי משום שרמת הבליעה הייתה בטווח הראוי

בשיטה הספקטרופוטומטרית- בדיקת ריכוז החלבון שהתקבל

בדקנו את רמת הביטוי של החלבון PON1 תחת זמני הדגרה שונים במשרן IPTG. לאחר ביצוע הניסוי המעשי, ניגשנו לשלושה ספקטרופוטומטרים שונים בעלי רגישויות שונות לבליעת אור עם שבע קיווטות הניסוי שלנו, וקיווטת הבלנק שמטרתה לאפס את הספקטרופוטומטר. לאחר בדיקת רמת הבליעה בשלושת הספקטרופוטומטרים, והצבת ערך רמת הבליעה במשוואת הקו הישר שהוצאה מן עקומת הכיול שהייתה נתונה לנו, הממצאים הוכיחו כי ריכוז החלבון שהתקבל היה הכי גבוה עבור ערך ההדגרה של שעה אחת.

לאחר חישוב ריכוז החלבון, חישבנו את כמות החלבון שהתקבל, על ידי הכפלת הריכוז שהתקבל עבור הערכים השונים כפול נפח בופר האילוציה (=75 מיקרוליטר), על פי הנוסחה.


חשוב לציין כי ערכי ריכוז החלבון אטשר התקבלו אינם מתייחסים אך ורק ל-PON1, אלא לכלל חלבוני התא אשר הופקו, ולכן אין קשר ישיר בין תוצאות השיטה הספקטרופוטומטרית לבין שיטת ההרצה בג'ל. כעבור שעה אחת (60 דקות) קיבלנו את ריכוז החלבון הכי גבוה- אך לאו דווקא ריכוז ה-PON1.

Big image
Big image

בדיקת רמת ביטוי

בבארות השונים החדרנו את שבעת זמני ההדגרה השונים, בסדר עולה מן הבארית השמאלית ביותר ועד הבארית הימנית ביותר לפני בארית סמני הגודל, בה החדרנו את סמני הגודל (מרקר). לאחר שעה של הרצה באלקטרופורזה בג'ל, התקבלו מקטעי חלבונים מופרדים על פי גודלם, אשר הבחנו בהם לאחר צביעה וטלטול. הממצאים אוששו את השערתנו- שתי הבאריות הימניות שבתמונה עבור ערך 40 קילודאלטון= לאחר שעתיים וחצי (150 דקות) ושלוש שעות (180) רמת הביטוי הינה הגבוהה ביותר, וככל שזמן ההדגרה היה קטן יותר, עובי וצבע המקטע היה צר יותר ובהיר יותר, משמע רמת הביטוי הייתה נמוכה יותר ככל שזמן ההדגרה היה נמוך יותר.


ניתוח התוצאות בהרצה בג'ל (SDS-PAGE) -

Big image

דיון בתוצאות ומסקנות

התייחסות לגרף ריכוז החלבון כתלות בזמן ההדגרה (בראדפורד)

הגרף שהתקבל מוכיח כי משך הדגרה של שעה מפיקה את הריכוז הגבוה ביותר של כלל חלבוני התא. חשוב להזכיר כי אין לכך קשר ישיר לרמת ביטוי החלבון PON1, משום שריאגנט בראדפורד נקשר גם לחלבוני תא אחרים, אשר נלקחים בחשבון בבדיקת ריכוז החלבון. אף על פי ההפרדה שקיימנו בקולונות, סביר להניח שהניקיון לא היה יסודי לגמרי, ושכמה חלבוני תא אחרים הצליחו להישאר במבחנת ה-PON1 שהתקבלה לאחר בופר ההדחה.

התייחסות להרצה בג'ל

השערתנו אוששה- ככל שהדגרנו את החיידקים הרקומביננטיים יותר זמן בIPTG, במסגרת הזמנים שהייתה לנו, רמת הביטוי שקיבלנו הייתה גבוהה יותר.

מצאנו כי הזמן האופטימלי להשראת החיידקים במשרן IPTG כדי שיבטאו את PON1 בוריאנט W.T הוא 3 שעות. בבסיס ההשערה, ככל שנשרה את החיידקים הרקומביננטיים ב-IPTG זמן רב יותר, כך החלבון תחת בקרת אופרון הלקטוז יבוא לידי ביטוי ברמה גבוהה יותר משום שבזכות ה-IPTG (אנאלוג ללקטוז) מתאפשרת בכלל פעולת הRNA Polimerase, ובסופו של דבר סנתוז החלבון עצמו.

לא הדגרנו את החיידקים הרקומביננטיים במשרן IPTG לזמן שארוך משלוש שעות, גם בגלל מגבלת הזמן שהייתה לנו, אך בעיקר משום שלאחר 3 שעות של הדגרה, החיידקים מסנתזים כמות רבה מדי של PON1 אשר מפריעים לתפקוד החיידק. לכן, החיידק כולא את הPON1 בגופיפי הסגר שבתוכם מולקולות הPON1 נקשרות אחת לשנייה, יוצרות אגרגטים, וכך הPON1 אינו מסיס ואינו פעיל.


הצעות לשיפור

חווינו הרבה היסוסים במהלך הניסוי שהיו עלולים להוביל לכישלון בניסוי, שככל הנראה נבעו ממחסור בזמן ולחץ של ניסוי חד פעמי שהצלחתו קריטית עבורנו. לשם שיפור הניסוי, היינו מציעים כמה שעות נוספות לניסוי, שיוכלו להפחית את הלחץ. בנוסף, בהתייחסות לשאלת המחקר שלנו, היינו רוצים לדעת אם עבור טווח זמנים גדול יותר של הדגרה ב-IPTG הייינו מקבלים רמת ביטוי גבוהה יותר מאשר שקיבלנו בשלוש שעות.

הצעות לכיווני המשך

לאחר ביצוע הניסוי והפקת מסקנות, עלתה בדעתנו השאלה- איך נמשיך מפה? לפי דעתנו, ניתן להמשיך את הניסוי על ידי חזרות רבות של שאלת המחקר שלנו, קבלת רעיון כללי ומדויק לגבי זמן ההדגרה האופטימלי במשרן IPTG.

לאחר קבלת רעיונות כלליים לגבי תנאים אופטימליים לביצוע הניסוי, וקבלת רעיון לגבי ההפקה האידיאלית של חלבון ה- PON1- יש להתחיל בייצורו. ישנם מצבים רבים בעולם בהם יש שימוש בנשק כימי מסוג גז העצבים, וזוהי האפשרות הטובה ביותר להציל את הקורבנות. הניסויים אשר אנו ביצענו ואלו שיבוצעו בעתיד יתרמו להפקה ברמה מקסימלית וטובה של האנזים PON1, ולבסוף להצלת חיים רבים של בני אדם הנתונים בסכנות.

התייחסות לקבוצת המחקר

לאחר התייחסות לקבוצת המחקר שלנו, ששאלת מחקרה הייתה דומה לשלנו מלבד לוריאנט ( 8C8- הוריאנט שלהן), גילינו כי הזמן האופטימלי להדגרת החיידקים הרקומביננטיים במשרן IPTG בוריאנט 8C8 הינו גם 3 שעות. מה זה אומר? סוג הוריאנט של PON1 אינו מהווה גורם משפיע לזמן הדגרה אופטימלי.

מצד שני, מסקנה זו אינה תקפה לגמרי, משום שלא נבדק הוריאנט H115W תחת שאלת המחקר שלנו, לכן אין לדעת אם הזמן האופטימלי להדגרת החיידקים במשרן IPTG דומה.

הגרף

על פי הגרף, ניתן לראות באופן מובהק את ערכי הזמן בהם מתקבל איכוז החלבון הגבוה ביותר, עבור כל וריאנט. בוריאנט שלנו, W.T, הזמן לו העמודה הגבוהה ביותר היא כעבור 60 דקות= שעה , בעוד בוריאנט 8C8 העמודה הגבוהה ביותר היא כעבור 120 דקות= שעתיים. קיימת סתירה. מדוע הזמנים האופטימליים שונים בין הוריאנטים? התשובה מסתתרת מאחורי העובדה שריכוז חלבוני התא אינו מעיד באופן ישיר על כמות הPON1 שיוצר, אלא על כלל חלבוני התא שלא נוקו כפי שקיווינו בקולונות.

Big image

ביבליוגרפיה

  • המחברת
  • אתר מכון ויצמן
  • ויקיפדיה
  • הפרוטוקולים שבעזרתם ביצענו את הניסוי
  • המאמר המרכזי- "ביטוי ואפיון של האנזים PON1 ככלי ביוטכנולוגי לפירוק גז עצבים", אשר עובד על ידי צוות מורים מומחים.

תודות

לענת קפלן, המורה שלנו לביוטכנולוגיה, שהכינה אותנו במשך כל הזמן הזה לניסוי והעבירה לנו את כל המידע הנחוץ על מנת לבצע את הניסוי ומעבר לו.

לגדי ערמוני וירדנה דוד, אשר עזרו לנו במשך הניסוי והנחו אותנו.

למכון ויצמן שאפשר לנו לבצע את הניסוי במעבדותיו ועל האירוח הנחמד.

נספחים